實時熒光定量pcr檢測方法第4課時實例

目錄

CONTENTS

Real-timePCR

引物及探針的設(shè)計及注意事項

常見問題及解決辦法

實例解析

融合基因可導(dǎo)致異常序列或功能的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，或者某些基因表達(dá)的失調(diào)，從而導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

9

22

22

BCR

9

BCR-ABL

ABL

cDNA

Realtime

PCR

RNA

BCR(ex12)

BCR(ex13) ABL ex2

BCR(ex13)

BCR(ex14)

ABL ex2

ex13 ex14

ex2

StandardF BCR-ABLR

BCR-ABL

Probe

ABLF

BCR-ABLF

ABLProbe

ABLR

注：紅字白底為BCR外顯子13；紅字黃底為BCR外顯子14；黑字白底為ABL外顯子2

/sms/rev_comp.html

BCR-ABL（P210） 1：

F:5'CAGACCCTGAGGCTCAAAGT3'

R:5'CTGTCCACAGCATTCCGC3'

1 5'FAM-CAGATGCTACTGGCCGCTGAAGG-TAMRA3'

BCR-ABL P210 2

F:5'CGGCTTCACTCAGACCCT3'

R:5'TTCCGCTGACCATCAATAAG3'

引物2探針：Pro:5'FAM-TGAGGCTCAAAGTCAGATGCTACTGGC-TAMRA3'

1

F:5'ACGAAGGGAGGGTGTACC

ATT3'

R:5'CCAGGGTGTTGAAGCGGC3'

1

Pro:5'FAM-TCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCTCC-TAMRA3'

2

F:5'CCAGGGTGTTGAAGCGGC3'

R:5'ACGAAGGGAGGGTGTACC

ATT3'

2

Pro:5'FAM-CGGAGGAGACGTAGAGCTTGCCATCAG-TAMRA3'

內(nèi)切酶

序列

鏈長

2h

20h

BamHⅠ

CGGATCCG

8

10

25

CGGGATCCCG

10

＞90

＞90

CGCGGATCCGCG

12

＞90

＞90

EcoRⅠ

GGAATTCC

8

＞90

＞90

CGGAATTCCG

10

＞90

＞90

CCGGAATTCCGG

12

＞90

＞90

Trizol

75%

RNA

RNA

DNA

ReverTraAceqPCRRTKit（TOYOBO）

Random Oligo-dT

23

2

copies/μL

1010 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100

3 Real-timePCR

1 106 105copies/μL

2 THUNDERBIRDProbeqPCRMix(TOYOBO )

3

試劑名稱 1×用量

THUNDERBIRDProbeqPCRMix 12.5μl

ForwardPrimer 0.8μl

ReversePrimer 0.8μl

TaqManProbe 0.4μlROXReferenceDye(50×) 0.5μldH2O 8.0μl

cDNA 2μl

Total 25μl

4

ABL

M-BCR(p210)

1

108 107 106 105 104 103 102 101copies/μL

M-BCR(p210) ABL

107106105104103

102

101

107106105104

103

102

101

107 106 105 104 103copies/μL

M-BCR(p210) ABL

107106

105

104

103

107106

105

104

103

Slope=-3.41R2=0.997E=96.45%

Slope=-3.25R2=0.996E=103.09%

M-BCR(p210) ABL

90%-110%

--- 12 5 2

10 1 1

M-BCR(p210)

ABL

10 ABL

M-BCR(p210)

10

ABL

ABL

M-BCR(p210)

M-BCR(p210)

ERCC1引物及探針：

F:5'GAGAGACGCCCAACCAGG3'

R:5'CGCACGAACTTCAGTACGG3'

Pro:5'FAM-CGGGGCAAAATCCAACAGCAT-TAMRA3’

β-actin引物及探針：

F:5’TGAGCGAGGCTACAGCTT3’R:5’TCCTTGATGTCGCGCACGATTT3’

Pro:5’FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA3’

：ReverTraAceqPCRRTKit（TOYOBO）

β-actinERCC1

結(jié)果：PCR擴(kuò)增曲線良好，提示引物、探針可用

β-actin

ERCC1

108

107106

105

104

108

107106

105

104

108 107 106 105 104

Slope=-3.57R2=0.999E=90.59%

Slope=-3.59R2=0.999E=89.91%

β-actin

ERCC1

ERCC1

(MeanQty)

β-actin(MeanQty)

NormalizedERCC1

Expression

CalibratedERCC1

Expression

1.83e+5

7.30e+5

0.25

1

24h

3.22e+5

8.70e+5

0.37

1.48

48h

4.35e+5

10.36e+5

0.42

1.68

72h

3.71e+5

5.71e+5

0.65

2.60

Relative