蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

1概述常量凱氏定氮法半微量凱氏定氮法蛋白質(zhì)及氨基酸的測(cè)定氨基酸定量測(cè)定蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法一般認(rèn)為成人每人每天營(yíng)養(yǎng)需要量為：75克蛋白質(zhì)。

1.蛋白質(zhì)的元素組成（Theelementsofprotein）

C：50-55%N：15-18%O：20-23%H：6-8%S：0-4%

微量元素：P、Fe、Zn、Cu但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志一概述22、基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸3

亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須依靠食品提供，故被稱為必需氨基酸，他們對(duì)人體有極其重要的生理作用。

43、食品中的蛋白質(zhì)含量一般說(shuō)來(lái)動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量>植物性食品

5牛肉豬肉兔肉雞肉

209.52120大豆米面粉菠菜蘋(píng)果

408.5102.4

0.44.測(cè)定蛋白質(zhì)的方法6二、常量凱氏定氮法1.原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量求出含氮量,乘以蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)即為食物中粗蛋白質(zhì)含量。78整個(gè)過(guò)程分四步：消化、蒸餾、吸收、滴定8①

消化

將樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為CO2和H2O逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨，并與硫酸結(jié)合成硫酸銨。2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O99硫酸鉀(或Na2SO4):作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解。硫酸銅（氧化汞、汞、硒）：作為催化劑、消化終點(diǎn)指示劑、堿性反應(yīng)指示劑濃硫酸：

a:利用脫水性，使有機(jī)物脫水后被碳化為C、H、N；b:利用強(qiáng)氧化性，使碳化后的C變?yōu)镃O2，使?jié)饬蛩嶙優(yōu)镾O2。101313②蒸餾在消化完全的樣品溶液中加入濃NaOH，使呈堿性，水蒸氣加熱蒸餾，釋放出氨氣。

2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3↑+Na2SO4+2H2O

14

用硼酸吸收形成硼酸銨。2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O14③吸收16

以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。16④滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3計(jì)算X=X為樣品中蛋白質(zhì)的含量V1為樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度m為樣品的質(zhì)量F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)0.014---1.00mL硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量18蛋白質(zhì)換算系數(shù)不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為為15%~17.6%，有的上下浮動(dòng)。

18=N×6.25=蛋白質(zhì)含量2020消化爐三、半微量凱氏定氮法23蒸餾吸收裝置三、半微量凱氏定氮法2424三、半微量凱氏定氮法2525三、半微量凱氏定氮法2626三、半微量凱氏定氮法272728計(jì)算28X:樣品中蛋白質(zhì)的含量，%；

V1:樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；

V2

:試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；V:樣品定容總體積，mL;

c:鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；m:樣品的質(zhì)量(體積)，g(ml)；

F:蛋白質(zhì)換算系數(shù);

0.014:mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；注意事項(xiàng)及說(shuō)明1、所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。2、蒸餾裝置不能漏氣。3、樣品應(yīng)是均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)，液體樣要混合均勻。4、消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。295、樣品放入凱氏燒瓶時(shí)，不要黏附瓶頸上，萬(wàn)一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。6、

若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。7、

樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。308、—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品。如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。9、消化時(shí)，如不容易呈透明溶液，可將凱氏燒瓶放冷后，加入30%過(guò)氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。3110、向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀。這是由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀；有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。11、硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。12、蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源。否則可能造成吸收液倒吸。3233蛋白質(zhì)測(cè)定儀---滴定34KDN型蛋白質(zhì)測(cè)定儀

35

36

現(xiàn)測(cè)定某一種食品的蛋白質(zhì)的含量，這種樣品含有大量的脂肪，樣品經(jīng)過(guò)處理后加入濃硫酸，為了使?jié)饬蛩崤c樣品充分結(jié)合，經(jīng)振搖后大火加熱進(jìn)行消化；消化2h后，估計(jì)消化完全，取出消化液加入少量NaOH進(jìn)行蒸餾，硼酸（加入了指示劑甲基紅-溴甲基酚綠）作為吸收液，最后對(duì)吸收液進(jìn)行滴定。討論振搖大火加熱消化2h后，估計(jì)消化完全量NaOH少38怎樣區(qū)分是否加入含氮物?在凱氏定氮法測(cè)定樣品的總含氮量之后,再取一份樣品,先用三氯乙酸處理樣品,讓蛋白質(zhì)形成沉淀。過(guò)濾后,分別測(cè)定沉淀和濾液中的氮含量,就可以知道蛋白質(zhì)的真正含量和冒充蛋白質(zhì)的物質(zhì)的氮含量。皮革奶

皮革水解蛋白的檢測(cè)難度比三聚氰胺更大，因?yàn)樗緛?lái)就是一種蛋白質(zhì)。目前農(nóng)業(yè)部規(guī)定的檢測(cè)方法，主要是檢查牛奶中是否含有皮革水解蛋白，這是動(dòng)物膠原蛋白中的特有成分，在乳酪蛋白中則沒(méi)有，所以一旦驗(yàn)出，則可認(rèn)為含有皮革水解蛋白。

所謂皮革水解蛋白粉，是指利用皮革生產(chǎn)過(guò)程中部分不能使用的皮革、毛發(fā)、毛囊等物質(zhì)，甚至是動(dòng)物屠宰場(chǎng)所收集的毛發(fā)類物質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法加工，使之水解成為蛋白質(zhì)。這種方法水解出來(lái)的蛋白質(zhì)，由于加工過(guò)程中帶入了重金屬鉻，原材料本身帶來(lái)的諸如二噁英、多氯聯(lián)苯等毒害物質(zhì)，使其不可能作為食品或者藥品級(jí)的添加劑。通過(guò)單獨(dú)的重金屬檢測(cè)確定是否添加不合格水解蛋白。四蛋白質(zhì)的快速的測(cè)定法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有害氣體污染環(huán)境，影響操作人員健康。新開(kāi)發(fā)的：

雙縮脲法、

福林-酚比色法、紫外分光光度法、考馬斯亮藍(lán)法、水楊酸比色法等421、雙縮脲法NH2—CO—NH—CO—NH2

+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2△150~160℃雙縮脲雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物。紫色絡(luò)和物。43442、福林-酚法（雙縮脲法的發(fā)展）兩步反應(yīng)(1)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅離子作用生成蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物。(2)此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸—磷鎢酸(Ｆolin試劑)還原，混合物深藍(lán)色(磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物)。A750(3)靈敏度高，酚類及檸檬酸對(duì)本法有干擾。451、雙指示劑甲醛滴定法

氨基酸本身有堿性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與-NH2結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來(lái)滴定-COOH基。46五氨基酸定量測(cè)定雙指示劑：百里酚酞+中性紅指示劑同時(shí)取兩份樣①+中性紅，用NaOH滴定

(6.4紅-8黃)②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定

(9.3無(wú)-10.5藍(lán))47琥珀色氨基酸態(tài)氮（%）式中c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/m

482、電位甲醛滴定法

根據(jù)氨基的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極和甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定的終點(diǎn)。pH8.29.249

在測(cè)定某廠醬油氨基酸態(tài)氮含量時(shí)，醬油5mg于100mL容量瓶中，加水定容，混勻后吸取此液20mL進(jìn)行測(cè)定，用0.05N氫氧化鈉滴定至pH值為8.2時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液7.0mL,加入10.0mL甲醛溶液，混勻。用標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液10.12mL,同法作空白實(shí)驗(yàn)，滴定至pH值為8.2時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液0.08mL,加入甲醛后滴定至pH9.2時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液0.90mL。問(wèn)該樣品的氨基酸態(tài)氮含量？0.645%你算對(duì)了嗎？503、茚三酮的比色法原理：氨基酸在堿性條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物