基于濁點(diǎn)萃取法同時(shí)測(cè)定人尿中殺鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆和溴鼠靈

基于濁點(diǎn)萃取法同時(shí)測(cè)定人尿中殺鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆和溴鼠靈

1常用抗凝血?dú)⑹髣┑乃幬锛胺治龇椒⑹箪`（3-（1-氨基丙烯酸-4-羥基香豆素）、殺鼠醚（4-羥基-3-（1-2，3-4-羥基-1-萘基）是第一種高毒性抗凝劑。溴敵?。?-[3-羥基-4-基]-3-羥基-1-硝基-4-硝基香豆素）和溴鼠靈（3-[3-c）-1.2.3-4-硝基-1-硝基香豆素）是抗凝劑，廣泛用于殺鼠和老鼠。由于使用不當(dāng)、誤食、人為投毒或長(zhǎng)期接觸此類鼠藥所引起的急、慢性中毒事件時(shí)有發(fā)生。殺鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆和溴鼠靈均為4-羥基香豆素類衍生物,中毒后引起的臨床癥狀相似,為了及時(shí)查明中毒原因并對(duì)癥治療,建立常用鼠藥的快速、簡(jiǎn)便、同時(shí)檢測(cè)的方法十分重要。測(cè)定生物樣品中的鼠藥含量通常采用高效液相色譜法、熒光光度法、示波極譜法及離子色譜-熒光檢測(cè)法等;其樣品前處理常用液-液萃取法、索氏萃取法或固相萃取法,有機(jī)試劑耗量大,費(fèi)時(shí)耗力。濁點(diǎn)萃取(cloudpointextraction,CPE)是近10年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種特殊的液-液萃取分離技術(shù),廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品的前處理中[8,9,10,11,12,13,14,15]。根據(jù)表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象,改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離,使表面活性劑結(jié)合的疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離,具有試劑用量小、環(huán)境友好、萃取效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究以非離子表面活性劑TritonX-114為萃取劑,濁點(diǎn)萃取-反相高效液相色譜法(RP-HPLC)同時(shí)測(cè)定了人尿中的殺鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆和溴鼠靈。2實(shí)驗(yàn)部分2.1材料、試劑與實(shí)驗(yàn)用水LC-10AtVP液相色譜儀(日本島津公司),配SPD-M10Avp型二極管陣列檢測(cè)器和Class-VP工作站;離心機(jī);漩渦混勻器;0.45μm的微孔濾膜。殺鼠靈純品(97.0%)及殺鼠醚純品(97.5%)由河北金賽制藥廠提供;溴敵隆純品(98.0%)、溴鼠靈純品(98.0%)由河南省商丘市大衛(wèi)化工廠提供;1%甲酸,分析純(北京化工廠);甲醇,色譜純(德國(guó)MERCK);實(shí)驗(yàn)用水(18.18MΩcm)由SG純水機(jī)制備;TritonX-114,純度>99.0%(北京拜爾迪生物公司),用水配成5%(m/V)TritonX-114。2.2配制鼠靈和溴鼠靈溶液準(zhǔn)確稱取殺鼠靈、殺鼠醚、溴鼠靈和溴敵隆純品各10.0mg,殺鼠醚、殺鼠靈和溴鼠靈用乙腈溶解,溴敵隆用甲醇超聲溶解,均分別定容至10mL容量瓶中,搖勻,使成為1000mg/L的儲(chǔ)備液,于4℃避光保存(6個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定),使用前用0.45μm濾膜過(guò)濾。臨用時(shí)用甲醇稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)系列。2.3tri頓x-119連續(xù)劑吸取離心后的尿樣5mL到已裝有0.03gNaCl的5mL具塞玻璃離心管中,旋渦振蕩使NaCl溶解;加入30μL甲酸和400μL5%TritonX-114,漩渦振蕩1min后,置于50℃水浴中放置15min,取出以3500r/min離心5min,加速兩相分離,再冰浴5min,快速小心地棄去上層水相,加入適當(dāng)體積的甲醇,混勻使富集相完全溶解于甲醇,過(guò)0.45μm濾膜后,濾液備用。2.4流動(dòng)相及過(guò)濾器色譜柱:Shim-packVP-ODSC18柱(150mm×4.6mm,4.6±0.3μm);柱溫40.0℃。流動(dòng)相:V(甲醇)∶V(1%甲酸)=90∶10;流速1.0mL/min,等度模式洗脫。二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)參數(shù):掃描波段190~470nm,檢測(cè)波長(zhǎng)306nm。進(jìn)樣量10μL。3結(jié)果與討論3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇3.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇TritonX-114具有較低的濁點(diǎn)溫度和較高的密度,在CPE中常用作萃取劑,但是它在紫外區(qū)有吸收,在HPLC-UV檢測(cè)時(shí)受到一定的限制。以V(甲醇)∶V(1%甲酸)=90∶10混合溶液為流動(dòng)相,用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)4種鼠藥單標(biāo)準(zhǔn)溶液和TritonX-114水溶液從190~470nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明,4種鼠藥在205nm處均有最大吸收,但這4種待測(cè)滅鼠藥分別在306、308、311和308nm處也有吸收。TritonX-114從190~295nm范圍內(nèi)均有較大的紫外吸收。比較TritonX-114、TritonX-114萃取后的空白尿液以及4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖可知,在檢測(cè)波長(zhǎng)小于300nm時(shí),萃取劑的色譜峰與目標(biāo)物有不同程度的疊加。但是,當(dāng)波長(zhǎng)大于300nm時(shí),萃取劑在目標(biāo)物的出峰處無(wú)吸收。實(shí)驗(yàn)選擇306nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。此時(shí)既兼顧了待測(cè)組分的靈敏度又避免了TritonX-114和尿樣背景對(duì)測(cè)定的干擾。5%TritonX-114、空白尿液萃取液及濃度各為20mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖分別見圖1中a、b、c,尿液中雜質(zhì)峰的保留時(shí)間為2min,保留時(shí)間為5.18min的峰來(lái)自TritonX-114。3.1.2流動(dòng)相配比的選擇以甲醇-1%甲酸為流動(dòng)相,改變兩者的體積比分別為85∶15、90∶10和95∶5,在流速為1.0mL/min,柱溫為40.0℃的條件下,考察3種不同體積比的流動(dòng)相對(duì)4種鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)的分離情況。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇與1%甲酸溶液的體積比為85∶15時(shí),4種待測(cè)組分在16min內(nèi)出峰,但峰形展寬;當(dāng)二者體積比為95∶5,待測(cè)組分出峰太快且殺鼠靈與殺鼠醚色譜峰重疊;當(dāng)二者體積比為90∶10(pH3.4)時(shí),待測(cè)組分不但能完全分離,并且峰形尖銳、對(duì)稱,出峰順序?yàn)闅⑹箪`,殺鼠醚,溴敵隆,溴鼠靈。所以流動(dòng)相選擇V(甲醇)∶V(1%甲酸)=90∶10溶液。3.2高效液相色譜測(cè)定為了得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和重現(xiàn)性,本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行CPE參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí),加入甲醇溶解富集相并稀釋至0.50mL,降低待測(cè)液的粘度后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。文中濃縮因子Fc定義為用于分析的原始尿液體積與富集相加入甲醇稀釋后的體積之比。3.2.1萃取溫度的選擇非離子表面活性劑萃取體系的溫度一般在濁點(diǎn)溫度以上15℃~20℃并保持一定時(shí)間。提高萃取溫度有利于兩相分離,從而提高萃取的速度。實(shí)驗(yàn)表明,尿液中TritonX-114的濃度在0.05%~0.60%時(shí),其濁點(diǎn)溫度變化幅度不大,為21℃~24℃。實(shí)驗(yàn)采用尿液中TritonX-114濃度為0.50%,改變濁點(diǎn)萃取的溫度分別為40℃、50℃和60℃,萃取15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在以上溫度條件下,萃取效率沒(méi)有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)選擇50℃和15min作為萃取的溫度和平衡時(shí)間。萃取后立即離心5min(3500r/min),兩相可完全分離,再冰浴5min以提高富集相的粘度。3.2.2萃取體系的優(yōu)化萃取體系中表面活性劑的濃度會(huì)影響萃取容量、富集相體積以及濃縮因子,繼而影響萃取效率。以加標(biāo)濃度為5mg/L的空白尿液5mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別加入200、300、400和500μL的5%TritonX-114溶液,按上述CPE條件進(jìn)行萃取,結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,隨著殺鼠靈,殺鼠醚,溴敵隆和溴鼠靈的辛醇-水分配常數(shù)LogP(octanol-water)值依次增大,其水溶性逐漸減小,萃取效率依次提高。當(dāng)萃取體系中5%TritonX-114的用量在200~400μL之間,溴敵隆和溴鼠靈的峰面積變化不大;當(dāng)加入量超過(guò)400μL時(shí),峰面積大幅降低;對(duì)于殺鼠靈和殺鼠醚,5%TritonX-114的用量為400μL時(shí)峰面積最大。所以,選擇5mL尿樣加入400μL5%TritonX-114萃取待測(cè)鼠藥,此時(shí)體系中的TritonX-114的濃度為0.37%(m/V)。3.2.3萃取體系的選擇CPE體系中增加萃取環(huán)境的離子強(qiáng)度,可使水相密度增大,降低極性物質(zhì)在水中的溶解性,更易于進(jìn)入富集相,另一方面也會(huì)使表面活性劑的疏水性增強(qiáng),促使兩相分離,達(dá)到提高萃取效率的目的。為了改善尿液在濁點(diǎn)萃取后兩相的分離,本實(shí)驗(yàn)選擇加入NaCl改變CPE體系離子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加入NaCl對(duì)溴敵隆及溴鼠靈的萃取效果影響不大,但能提高殺鼠靈和殺鼠醚的萃取效率,體系中加入0.1mol/LNaCl時(shí)的萃取效率比不加NaCl時(shí)分別提高了6%和11%。但隨著NaCl濃度增加,用甲醇溶解富集相時(shí)較為困難,且待測(cè)液混濁,可能是鹽析效應(yīng),使表面活性劑的疏水性增加,在富集相的體積減少的同時(shí),形成剛性液態(tài)晶體或以固態(tài)富集相沉淀出來(lái)所致,增加了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的難度。所以,實(shí)驗(yàn)中選擇萃取體系中NaCl的濃度為0.1mol/L。為減小萃取體系的體積,在5mL尿液中加入0.03gNaCl溶解后進(jìn)行濁點(diǎn)萃取。3.2.4酸度對(duì)萃取效率的影響萃取體系的酸堿度影響目標(biāo)物在萃取環(huán)境中的存在狀態(tài),從而影響萃取效率。所測(cè)4種鼠藥均為弱酸性有機(jī)物,為了得到較高的萃取效率,對(duì)萃取體系的酸度進(jìn)行了研究。因流動(dòng)相中含有甲酸,選擇甲酸調(diào)節(jié)萃取體系的pH值,考察酸度對(duì)萃取效率的影響,結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)表明,溴敵隆和溴鼠靈的萃取效率隨著酸度的增加影響較小,而酸度對(duì)殺鼠靈和殺鼠醚的影響很大。隨著萃取體系pH的減小,殺鼠靈和殺鼠醚的萃取效率大幅度提高,當(dāng)體系中pH為3.3時(shí),萃取效率達(dá)最大;pH值在2.5~3.3之間時(shí),4種待測(cè)物的回收率變化不大,但萃取體系的濁點(diǎn)溫度降低,富集相難以完全溶解。所以,選擇萃取體系的最佳pH值為3.3。3.2.5富集相的體積CPE的優(yōu)點(diǎn)在于可以用盡量小體積的甲醇稀釋富集相,增大濃縮因子(Fc),從而降低檢出限。實(shí)驗(yàn)采用差減法計(jì)算CPE后富集相的體積,即萃取后加入定量的甲醇至0.50mL,減去加入的甲醇體積即可得到富集相的體積。本實(shí)驗(yàn)萃取體系中富集相的體積約為130μL(n=15)。加入不同體積的甲醇稀釋富集相,可得到理論濃縮因子與甲醇體積的關(guān)系曲線。當(dāng)加入50μL甲醇,樣品濃縮因子可達(dá)近28倍。隨著測(cè)定液體積的減小,樣品背景值增大。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)甲醇的加入量小于50μL時(shí),尿樣背景峰干擾殺鼠靈的測(cè)定。所以,檢測(cè)殺鼠靈時(shí),用甲醇稀釋的體積應(yīng)大于50μL。3.3回收率、精密度及色譜圖在陰性尿液中加入4種鼠藥的混和標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成從0.01~5.0mg/L不同濃度的加標(biāo)系列,每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定3次,CPE后用甲醇稀釋并定容至0.50mL。以各組分的峰面積(Y)平均值對(duì)加標(biāo)濃度(X,mg/L)進(jìn)行線性回歸,得出工作曲線,計(jì)算平均回收率及精密度。配制一系列低濃度的加標(biāo)樣品,CPE后加入50μL甲醇進(jìn)行稀釋,進(jìn)樣10μL,以信噪比(S/N)為3時(shí)所檢出的樣品濃度為定量檢出濃度,本方法的定量檢出濃度分別為殺鼠靈0.016mg/L、殺鼠醚0.001mg/L、溴敵隆0.005mg/L、溴鼠靈0