003-第二章-細胞生長動力學

第二章細胞生長和產(chǎn)物生成的計量學與動力學夏建業(yè)2023最新整理收集do

something2/48解決兩個基本問題:計量學問題——過程中涉及的各種物料和能量的比例關系；動力學問題——細胞生長、底物消耗和產(chǎn)物生產(chǎn)的速率問題。3/48細胞反應概論細胞的基本特征細胞組成：90%為C、H、O、N，還有S、P、Na、Ca、K、Cl、Mg、Fe八種元素，以上12種元素占細胞質(zhì)量的99%以上活細胞80~95%是水，干物質(zhì)中主要有蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂質(zhì)形狀：影響細胞生長速度，絲狀速度??；影響剪切耐受；影響傳質(zhì)大?。罕确磻髯銐蛐?，比分子足夠大物質(zhì)的跨膜運輸簡單擴散；促進擴散；主動輸運胞內(nèi)代謝反應供能反應；生物合成反應；多聚反應；組裝反應初級代謝與次級代謝胞內(nèi)代謝調(diào)控通過酶進行調(diào)控：活性調(diào)節(jié)，酶量調(diào)節(jié)（誘導與阻遏）4/48第一節(jié)生物反應過程的計量細胞的生長與代謝涉及大量的反應成分和復雜的反應途徑，但仍然服從物質(zhì)守恒定律。對于培養(yǎng)基組成，最簡單的計量學約束條件是：如果總細胞量要達到cx，元素i在細胞中的分率為Wi，那么，元素i在所有底物中的總量至少為Wicx。事實上，問題要復雜的多（1）某些底物中的元素變成產(chǎn)物，而非細胞物質(zhì)；（2）不僅要考慮計量學限制，還要考慮速率限制；（3）某些營養(yǎng)物是限制性的，或者某些產(chǎn)物是抑制性的。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)種類很多，在計量學和動力學上不可能一一考慮，必須找到問題的關鍵。5/48速率限制性底物：加入少量可使生長速率隨之增加的物質(zhì)。計量學限制性底物：首先消耗完的物質(zhì)（一個生長過程只有一種）。得率系數(shù)YX/S：增加的細胞量

被利用的底物量：YX/S=-

Cx/

Cs

總得率系數(shù)底物消耗：

CS=

CS同化

+

CS生長能

+

CS維持能

+

CS代謝產(chǎn)物其中真正的得率系數(shù)為－

CX/

CS同化恒定，而總總率系數(shù)往往不是常數(shù)。細胞迅速生長時，較多地底物用于同化和生長能，而靜止期的細胞消耗的底物則用于維持而不生長，此時YX/S=0。同化（assimilateoranabolism）：將外界環(huán)境中獲取的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細胞的組成成分，涉及一系列的生物合成，導向細胞合成異化（dissimilateorcatabolism）：細胞將大分分解為二氧化碳和水，異化過程為同化提供能量反應計量學基本概念6/48二、研究方法：物料衡算（元素平衡）1.通用分子式碳源

CHxOy；氮源

HlOmNn；細胞

CH

O

N

2.無產(chǎn)物形成時的生長反應3.元素平衡

C:a’+0+0=1+0+e’H:a’x+0+c’l=

+2d’+0O:a’y+2b’+c’m=+d’+2e’N:0+0+c’n=+0+0反應過程的計量學方法7/484.呼吸商可由實驗確定。由元素平衡和呼吸商可構(gòu)成矩陣方程：其中對該方程求解即可得到關于該生長反應的計量學系數(shù)反應過程的計量學方法8/48基本變量定義還原價分別表示生物體、碳源、氮源的還原價C的還原價為+4，H為+1，O為-2，N為-3。CHrOsNv

的還原價為εS

每個C原子底物水平磷酸化產(chǎn)生的ATP數(shù)P/O比細胞每消耗一個O原子的ADP磷酸化數(shù)，表征氧化磷酸化的效率，與培養(yǎng)條件有關9/48化學異養(yǎng)有氧生長計量學化學異養(yǎng)生物，有氧生長的計量學關系往往要復雜得多。若考慮ATP生成和利用，有如下關系：氧化磷酸化：能源異化：10/48化學異養(yǎng)有氧生長計量學維持和耗散：

生物合成：11/48當有產(chǎn)物生成時1.通用分子式碳源

CHxOy；氮源

HlOmNn；細胞

CH

O

N

產(chǎn)物

CHvOw2.產(chǎn)物形成時的生長反應3.元素平衡

C:a’+0+0=1+0+e’+f’H:a’x+0+c’l=

+2d’+0+f’vO:a’y+2b’+c’m=+d’+2e’+f’wN:0+0+c’n=+0+0+0反應過程的計量學方法12/48部分宏觀得率系數(shù)匯總13/48例題葡萄糖為碳源，NH3為氮源進行某種細菌的好氧培養(yǎng)，消耗的葡萄糖中有2/3的碳源轉(zhuǎn)化為細胞中的碳，反應式為：計算上述反應中的細胞得率YX/S和YX/O。14/48例題葡萄糖為唯一碳源進行酵母培養(yǎng)，反應式為試求：（1）細胞得率YX/S（2）生成1kg細胞的反應熱？已知酵母細胞和葡萄糖的燃燒熱分別是1.5*104kJ/kg和1.59*104kJ/kg15/48例題某細胞反應平衡式為：若上述反應中：m=2，l=1,p=13/8,n=1/2,q=1/3試求該平衡式中計量系數(shù)a、b、c和RQ值，以及YX/S和YX/O的值16/48反應計量學中的一些基礎知識獨立反應數(shù)其中只有2個反應是獨立的，因為任一個反應可由另兩個反應線性組合而成。原子矩陣M為化合物，E為元素式中共S個物質(zhì)，R種元素17/48獨立反應數(shù)也可以用化學計量系數(shù)法來確定，對于S種物質(zhì)A1,A2,…,As之間進行R個反應時，計量系數(shù)矩陣為可記作：ARs=(

ij)計量系數(shù)矩陣的秩為K，記作

r(A)=K此計量系數(shù)矩陣的秩即為獨立反應數(shù)。反應計量學中的一些技巧知識18/48細胞反應動力學模型的分類從細胞水平分非結(jié)構(gòu)化模型：不考慮胞內(nèi)存在的各種反應和組分；細胞被視為組成恒定的生物相；唯一的變量是細胞濃度---（均衡生長）結(jié)構(gòu)化模型：胞內(nèi)存在若干關鍵組分或結(jié)構(gòu)單元；細胞組成和性質(zhì)將隨反應進行而變化；細胞需要多于一個以上的變量描述（非均衡生長）從細胞群體水平分非分離模型：不考慮細胞個體間的差異對反應的影響分離模型：考慮細胞個體差異對反應的影響19/48基本的動力學機理非結(jié)構(gòu)模型1.假定細胞可以用單位體積中細胞的質(zhì)量或細胞個數(shù)表示，將細胞看作化學組成一定的反應物，不考慮細胞生長過程中的內(nèi)部成分變化。2.整個培養(yǎng)過程中，細胞群體的質(zhì)量分布是均勻的。3.以底物、活細胞、非活細胞和分泌產(chǎn)物為主要成分。4.常采用速率限制性底物的概念。5.局限性：不適用于放大。底物S活菌X+活菌X非活菌Xd產(chǎn)物P菌體自溶20/48細胞反應結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型考慮細胞組成的多樣性及它們之間的反應，將細胞分成幾個部分，如最簡單的結(jié)構(gòu)機理：細胞＝合成機構(gòu)（D）＋遺傳部分（G）。SDG21/48結(jié)構(gòu)化模型2.復雜的結(jié)構(gòu)化代謝模型22/48結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)動力學模型的選擇如果僅是模擬反應過程中生物質(zhì)的總量或濃度隨時間的變化，則可以采用最簡單的非結(jié)構(gòu)模型；如果是要模擬細胞內(nèi)部的生長動態(tài)特性，則宜采用結(jié)構(gòu)模型處理。如果要研究不同細胞群體分布對細胞反應動力學的影響，則應采用相應的分離模型。23/48動力學速率方程底物消耗細胞物質(zhì)需ATP需C源和N源產(chǎn)物底物氧化成CO2、水產(chǎn)ATP需C源和O2第一類產(chǎn)物（底物降解成簡單產(chǎn)物）乙醇、乳酸、檸檬酸、底物水平磷酸化、CO2、水產(chǎn)ATP需C源無O2第二類產(chǎn)物胞外酶、多糖、抗生素等需ATP需C源和N源第三類產(chǎn)物（含碳底物過量，含氮鎂等底物限制）蓄能化合物：胞內(nèi)糖原、脂肪、多糖需ATP需C源提供能量進行合成反應需ATP維持胞內(nèi)外濃度差異維持能需ATP胞內(nèi)轉(zhuǎn)化反應需ATP24/48底物的流向25/48能源的產(chǎn)生與消耗NCHOO2CO2，H2O第一類產(chǎn)物第三類產(chǎn)物第二類產(chǎn)物細胞物質(zhì)用于維持的ATP26/48三個平衡方程C、N、O平衡總ATP平衡七個速率表達式氧消耗速率，rO菌體生成速率，rX第一類產(chǎn)物生成速率，rP1第二類產(chǎn)物生成速率，rP2第三類產(chǎn)物生成速率，rP3C底物總的消耗速率，rSN底物總的消耗速率，rN實際不能把氧化磷酸化產(chǎn)生的CO2和水和作為第一類產(chǎn)物的CO2區(qū)分開來，因此氧平衡往往被忽略四個獨立的速率方程27/48三個衡算式CNATP28/48S1限制性反應步驟限制性途徑細胞生長與抑制限制性底物

假定速率控制反應中，酶濃度正比于細胞濃度，底物濃度正比于限制性底物濃度，那么對于細胞生長，可以寫出與酶催化反應米氏方程類似的形式：S2S329/48cS>>KS，μ為定值，則表明處于對數(shù)生長期，即rX與cX成正比。比生長速率與細胞倍增時間的關系：雙底物限制底物抑制生長抑制（底物、產(chǎn)物或其他物質(zhì)）Monod方程的特征—細胞生長速率30/48細胞維持速率方程產(chǎn)生維持能而消耗底物的速率：m=0.02~4kg底物/(kg細胞·h)根據(jù)消耗的ATP，維持方程為：mATP=0.5~200molATP/(m3·h)影響m值的因素：環(huán)境條件：培養(yǎng)基鹽濃度，pH（環(huán)境改變，細胞調(diào)節(jié)酶的表達，則蛋白的合成加快，使m值增加）細胞生長速率:生長條件不變時,用于細胞物質(zhì)重新合成的維持能比較低,但當停止生長,細胞適應新的底物時,就比較高。31/48細胞死亡速率方程非活性細胞細胞轉(zhuǎn)化為非活細胞的速率：底物濃度對kd的影響：cS為0時，kd＝kdmax；cS很高時，kd最小。死亡——水解假死——短期不會轉(zhuǎn)化為活性細胞32/48產(chǎn)物形成速率方程產(chǎn)物形成的模型：1.乳酸發(fā)酵為厭氧過程，因此，沒有第二類和第三類產(chǎn)物生成，即rO=0，rP2=0，rP3=0。對第一類產(chǎn)物乳酸作ATP平衡：其中rmATP=mATPcX，則2.第二類產(chǎn)物：維持高有利于第一類產(chǎn)物的形成抑制細胞生長，氧攝取速率大有利于第二類產(chǎn)物的形成33/48葡萄糖生成乙醇為例34/48溫度的影響當溫度低于最適生長溫度時：Ea為細胞生長活化能，50~70kJ/mol當溫度高于最適溫度時，細胞的凈比生長速率μ可表示為kd也可表示為:Ed為死亡活化能，300~380kJ/mol溫度和pH的影響35/482.pH的影響（在酶特性基礎上建立起來，而酶由氨基酸組成，因而具有酸、堿和中性形式）

K1

K2

酸性X+?活細胞X?堿性X-

活細胞分率對于多數(shù)細胞，pHopt＝6.5±1，pK2-pK1＝2±136/48重組微生物的穩(wěn)定性

重組微生物表達外源蛋白的過程中，隨著代數(shù)的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率下降，這是由于重組微生物的穩(wěn)定性問題造成的，其機理為：（1）細胞分裂時，質(zhì)粒的缺陷性分配；（2）質(zhì)粒DNA突變導致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。37/48例題在分批操作反應器中利用攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌進行重組蛋白的生產(chǎn)。每經(jīng)過一世代，其質(zhì)粒丟失的概率為0.005，無質(zhì)粒細胞的比生長速率為1.4h-1，帶質(zhì)粒細胞的比生長速率為1.2h-1。如果接種時均為帶質(zhì)粒的細胞，試估計經(jīng)過18h培養(yǎng)后，攜帶質(zhì)粒細胞所占分率？該問題如何求解？38/48重組微生物的發(fā)酵動力學Xc：攜帶質(zhì)粒的細胞；Xf：質(zhì)粒丟失的細胞；p：每次分裂產(chǎn)生質(zhì)粒丟失的細胞的概率；Np：N個細胞經(jīng)過一次分裂，產(chǎn)生質(zhì)粒丟失的細胞個數(shù)；N(1-p)：N個細胞經(jīng)過一次分裂，產(chǎn)生攜帶質(zhì)粒的細胞個數(shù)；N(2-p)：N個細胞經(jīng)過一次分裂，攜帶質(zhì)粒的細胞總數(shù)；

+：攜帶質(zhì)粒的細胞在對數(shù)生長期的比生長速率；

-：質(zhì)粒丟失的細胞在對數(shù)生長期的比生長速率。Xc(2-p)XcpXf

+

+Xf2Xf

-39/48攜帶質(zhì)粒的細胞生長速率丟失質(zhì)粒的細胞生長速率假定為常數(shù)，則代入第二個方程，得求解非齊次線性微分方程，得則攜帶質(zhì)粒的細胞分率為40/48攜帶質(zhì)粒細胞的倍增時間：經(jīng)過時間t后攜帶質(zhì)粒細胞的培養(yǎng)代數(shù)：如果開始都是攜帶質(zhì)粒的細胞，培養(yǎng)到n代時的f為：結(jié)合和可以得出：41/48f25隨

，p的增加而減少，p≤0.01和

<1時，f25接近1。p固定，f隨

，n的增加而減少，

＝1.4，n≈

30時，f≈0，

＝2.0，n≈14時，f≈0。42/48例題Q6:Estimatethenumberofgenerationsofgrowthneededforgeneticallymodifiedmicroorganismsfrom1mlculturetoa33,000Lproduction-scalefermenter.Assumethattheinoculumsizeineachstageofthescale-upis5%exceptthefirstinoculationstep.A:Inoculumsize=5%exceptthefirstinoculationstep.0.001

0.010

0.206

4.125

82.5

1650

33000放大倍數(shù)：33000/0.001=33000000分裂n次后的總量：N=N0

2

2

=N02n放大倍數(shù)=N/N0=N02n/N0=2n傳代數(shù)n=ln放大倍數(shù)/ln2總傳代數(shù)=5

ln20/ln2+ln10/ln2≈2543/48Q7:Forarecombinantmicroorganism(E.coli)containingplasmids,theprobabilitypergenerationofproducingacellwithoutplasmid(p)is0.001andtheratioofthespecificgrowthrates,

-/+is1.2.Calculatethefractionoftheplasmid-carryingcellswhenthecellsarefullygrownina64Lfermenter.Theinoculationwascarriedoutbyseveralstepsfrom1mLstockculture.Theinoculumsizeforeachstepis2.5%.A:1mL→40mL→1.6L→64LEachscale-up,ln40/ln2=5.3generationsTotalgenerations5.3

3=1644/48連續(xù)攪拌發(fā)酵罐中的培養(yǎng)在連續(xù)攪拌發(fā)酵罐中，對于攜帶質(zhì)粒細胞的物料平衡為:對于丟失質(zhì)粒細胞的