真菌的遺傳分析課件

真核生物特殊染色體作圖真菌的染色體作圖酵母的無序四分體分析真菌廣泛分布于全球各帶的土壤、水體、動植物及其殘骸和空氣中，營腐生、寄生和共生生活。自林奈把生物區(qū)分為動物和植物兩界以后的200多年以來，真菌因固著生活和細胞具有細胞壁而一直被歸入植物界。從20世紀中葉起，生物學(xué)家認為真菌的起源、組織、營養(yǎng)方式和細胞壁的組分等都與植物不同，把它歸入植物界并不妥當。真菌營養(yǎng)方式是“吸收異養(yǎng)型〞，主要作用是分解,它與植物的光合自養(yǎng)和動物的攝食異養(yǎng),都有著本質(zhì)的區(qū)別。所以,在近20～30年的4界以上分類系統(tǒng)中，大多將真菌獨立成界。真菌的染色體作圖一、真菌的相關(guān)背景腳氣頭癬灰指甲真菌與人類的關(guān)系真菌的繁殖方式包括無性生殖、有性生殖；無性生殖:是指不經(jīng)過兩性細胞的結(jié)合便產(chǎn)生新的個體。生殖方法有：①體細胞〔菌絲〕的斷裂；②體細胞分裂成子細胞；③體細胞或孢子的芽殖；④各種無性孢子〔如游動孢子、孢囊孢子、分生孢子、厚垣孢子等〕的產(chǎn)生，每個孢子可萌生芽管，再形成菌絲體。無性生殖在真菌的繁衍和傳播上起重要作用。有性生殖:有游動配子配合、配子囊接觸交配、配子囊交配、性孢子配合和體細胞配合等形式。真菌的生殖鏈孢霉的野生型又稱為原養(yǎng)型〔prototroph〕，在根本培養(yǎng)基上就能生長，子囊孢子按時成熟呈黑色。鏈孢霉的營養(yǎng)缺陷型〔auxotroph〕，有一類突變型是不能合成某些物質(zhì)，在根本培養(yǎng)基上不能生長，只能在選擇性培養(yǎng)基上生長。如賴氨酸缺陷型是自己不能合成賴氨酸，因此培養(yǎng)時必須在根本培養(yǎng)基上參加適量的賴氨酸，此種缺陷型才能生長。缺陷型比野生型的子囊孢子成熟得慢，所以鏡檢時突變型的子囊孢子呈白色，和黑色的野生型子囊孢子很容易分辨在同源染色體上如果有一對等位基因A和a，如果交換發(fā)生在A和著絲點之外，那么在第一次減數(shù)分裂時A和a就完全分開進入不同的兩極，至于各向哪一極移動是隨機的，但一旦確定就決定了以后子囊孢子排列的位置。第二次減數(shù)分裂時，染色單體各自分開，分別進入4個孢子，進一步有絲分裂形成了8個子囊孢子，野生型為黑色，營養(yǎng)缺陷型為白色，4黑4白有序排列，這種類型說明在A和著絲點之間未發(fā)生交換，或沒有有效的交換。此稱為第一次分裂別離〔firstdivisionsegregation〕。假設(shè)在A基因和著絲點之間發(fā)生了一次交換，那么第一次減數(shù)分裂時，一對同源染色體的兩條姊妹染色單體攜帶了A和a，進入同一個子細胞，A和a沒有別離，同樣它們趨向兩極時是隨機的，直到第二次減數(shù)分裂形成四分子時，著絲粒也分開，A和a才分開，各自進入一個子囊孢子中，故稱為第二次分裂別離〔seconddivisionsegregation〕。第二次分裂時A和a趨向哪一級也是隨機的，一旦確定就決定了最后的8個子囊孢子的排列方式。由于第一次和第二次減數(shù)分裂的隨機性，最后8個子囊孢子的排列有幾種不同的組合，但決不會是4黑4白，總是兩兩相間。第二次別離說明在標記基因和著絲粒之間發(fā)生了一次交換。第一次別離和第二次別離的模式圖第一次分裂別離:＋＋－－第二次分裂別離:＋＋－－＋－＋－＋－－＋－＋＋－－＋－＋著絲粒作圖〔centromeremapping〕就是利用分裂別離來確定是否重組，再來計算標記基因到著絲點之間的圖距。重組率=(交換型子囊數(shù)/總子囊數(shù))×1/2×100％這一公式和真核生物的重組率的計算原理相同，都是計算重組型占后代總數(shù)的比。因為我們統(tǒng)計的單位不是子囊孢子，而是一個子囊中含有8個子囊孢子，它們來自四條染色單體，即使是重組型的子囊里面含的四條染色單體中也只有兩條發(fā)生了交換，還有兩條未發(fā)生交換，所以必須乘以1/2。三、鏈孢霉的連鎖作圖

（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）四分體基因型＋

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+分裂分離M=1\*ROMANI

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M=2\*ROMANII子囊類型（PD）（NPD）（T）（T）（PD）（NPD）（T）子囊數(shù)80819059015染色體交換根據(jù)著絲粒作圖公式可算出各標記與著絲粒之間的圖距。著絲粒與nic座位之間的圖距可通過各種子囊型中重組型的子囊數(shù)來計算，根據(jù)表，只有第4，5，6，7型子囊在nic和著絲粒之間才存在MII，即發(fā)生交換重組，所以RF〔著絲粒-nic〕=[(4)(5)(6)(7)/1000]51/25100%=[(5+90+1+5)/1000]×1/2=5.05%=5.05(m.u)同理RF〔著絲粒-ad〕=[(3)(5)(6)(7)/1000]51/25100%=[(90+90+1+5)/1000]×1/2=9.30%=9.30(m.u)計算的結(jié)果告訴我們nic和著絲點之間的距離為5.05圖距單位〔m.u.〕。ad和著絲點之間的9.30(m.u)目前知道了nic和ad是在同一條染色體上以及它們和著絲點的距離，排除以下圖的第一種可能；但還不知道具體的順序排列。因根據(jù)目前的信息有兩種可能：〔1〕nic和ad分別位于著絲點的兩側(cè)；〔2〕nic和ad位于著絲粒的同側(cè)假設(shè)兩個位點在著絲點的兩側(cè)，那么nic和著絲點之間的重組與ad和著絲點之間的重組上各自獨立的，也就是說nic和著絲點之間發(fā)生一次重組不會影響到ad和著絲點之間的關(guān)系；相反，假設(shè)兩個座位都在著絲點的同側(cè)，一旦nic和著絲點之間發(fā)生了一次交換，假設(shè)不存在雙交換的話，勢必使ad和著絲粒也產(chǎn)生重組。從前面的資料來看，nic和著絲粒之間產(chǎn)生的子囊為〔4〕〔5〕〔6〕〔7〕，共101個子囊，其中〔5〕〔6〕〔7〕型子囊共96個同時也發(fā)生了ad和著絲粒之間的重組，說明根本是符合第二種情況，那么為什么有五次不同步發(fā)生重組呢？從表中不難看出，不同步的僅為第四種子囊型，兩個座位分別為MII、MI，共5個子囊，從重組的圖中很清楚地看到是由于在nic和ad之間發(fā)生了一次雙交換，結(jié)果使ad和著絲粒之間未能重組。1、鏈孢霉后代多，樣本大，統(tǒng)計分析的誤差?。?、生活周期段短，在短時間內(nèi)可獲得結(jié)果。3、鏈孢霉易培養(yǎng)和操作，可利用選擇培養(yǎng)基篩選各種突變型；4、子囊孢子是單倍體，不存在顯隱性的問題，表型和基因型一致；5、鏈孢霉又屬真核生物，可作為真核的研究模型，因此是很好的遺傳學(xué)實驗材料。鏈孢霉用于遺傳分析的優(yōu)點酵母的無序四分子分析一、無序四分子有些真核生物產(chǎn)生的孢子不像鏈孢霉產(chǎn)生有序的排列孢子，這種沒有特殊順序四分子或者八孢子的遺傳重組分析過程，就是無序四分子分析。酵母的有性生殖例如：現(xiàn)在假設(shè)酵母有兩基因位點a和b，我們想確定它們是否連鎖，如果連鎖還要計算ab之間的圖距。處在兩條染色體上的遺傳圖示當兩個基因a、b在不同染色體上時，PD和NPD的四分體不是因為交換而產(chǎn)生，而是由于在減數(shù)分裂中期染色體的不同排列所造成的。由于四條染色體在中期板上排列的狀態(tài)是獨立的，一對同源染色體分別向兩極的移動是隨機的，所以PD和NPD型的四分子的頻率相等，NPD應(yīng)占50％如果兩個基因連鎖，各種四分體的類型如以下圖所示，假設(shè)未發(fā)生交換，產(chǎn)生親二型〔PD〕，如在兩個基因間發(fā)生一次交換，結(jié)果產(chǎn)生兩個親組合和兩個重組合的染色體稱為四型〔T〕。假設(shè)發(fā)生雙交換的話，仍是親二型〔PD〕；假設(shè)發(fā)生三鏈交換的話，那么涉及到四條染色體中的三條，有兩種形式：1－3三鏈雙交換和2－4三鏈雙交換，其結(jié)果是產(chǎn)生四型的子囊，即兩條染色體是重組的，兩條染色體是親組合的。最后一種是四鏈雙交換，產(chǎn)生的子囊是NPD。NPD是4種雙交換中的一種，應(yīng)當比較少。如以下圖所示

abPDABNCOababABABabaBAbABababABABaBabAbABabaBABAbaBaBAbAb

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abNPDABDCO連鎖遺傳的圖示如果PD的頻率遠大于NPD子囊的頻率，即PD>>NPD，我們就可以推斷這兩個基因是連鎖的。一旦已確定兩個基因是連鎖的，只要具有各種類型子囊數(shù)據(jù)的資料，就可以根據(jù)作圖公式來計算兩個基因之間的距離分子標記作圖分子標記：是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為根底的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映；與形態(tài)學(xué)標記、生物化學(xué)標記、細胞學(xué)標記統(tǒng)稱為遺傳標記一、分子標記的相關(guān)知識廣義的分子標記是指可遺傳的、并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標記包括種子貯藏蛋白和同工酶〔指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式〕及等位酶〔指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式〕。狹義的分子標記概念只是指DNA標記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納。本文中也將分子標記概念限定在DNA標記范疇。形態(tài)標記：指肉眼可見的或儀器測量動物的外部特征(如毛色、體型、外形、皮膚結(jié)構(gòu)等)，以這種形態(tài)性狀、生理性狀及生態(tài)地理分布等待征為遺傳標記，研究物種間的關(guān)系、分類和鑒定。形態(tài)學(xué)標記研究物種是基于個體性狀描述，得到的結(jié)論不夠完善，且數(shù)量性狀很難剔除環(huán)境的影響，需生物統(tǒng)計學(xué)知識進行嚴密的分析。但是用直觀的標記研究質(zhì)量性狀的遺傳顯得更簡單、更方便。目前此法仍是一種有效手段并發(fā)揮著重要作用。生物化學(xué)標記：以動物體內(nèi)的某些生化性狀為遺傳標記，主要指血型、血清蛋白及同工酶。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)作為檢測遺傳特性的一種主要方法得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白電泳所檢測的主要是血漿和血細胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，通過對一系列蛋白和同工酶的檢測，就可為動物品種內(nèi)的遺傳變異和品種間的親緣關(guān)系提供有用的信息。但是，蛋白和同工酶都是基因的表達產(chǎn)物，非遺傳物質(zhì)本身，它們的表現(xiàn)易受環(huán)境和發(fā)育狀況的影響；這些因素決定了蛋白電泳具有一定的局限性，但是蛋白電泳技術(shù)操作簡便、快速及檢測費用相對較低，日前仍是遺傳特性研究中應(yīng)用較多的方法之一。細胞遺傳標記：遺傳標記的一種，指對處理過的動物個體染色體數(shù)目和形態(tài)進行分析，主要包括：染色體核型和帶型及缺失、重復(fù)、易位、倒位等。一個物種的核型特征即染色體數(shù)目、形態(tài)及行為的穩(wěn)定是相對的，故可作為一種遺傳標記來測定基因所在的染色體及在染色體上的相對位置，染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是基因的攜帶者，染色體變異必然會導(dǎo)致生物體發(fā)生遺傳變異，是遺傳變異的重要來源。通過比較動物與其近緣祖先的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)，追溯動物的起源和演化，檢測動物的遺傳特性，為動物育種提供較好的方法。理想的分子標記必須達以下幾個要求：具有高的多態(tài)性；(2)共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3)能明確區(qū)分等位基因；(4)遍布整個基因組；除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組；(5)選擇中性(即無基因多效性)；(6)檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化)；(7)開發(fā)本錢和使用本錢盡量低廉；(8)在實驗室內(nèi)和實驗室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標記均不能滿足以上所有要求。1、限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

RFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標記。原理：用限制性內(nèi)切酶切割不同個體的DNA時，如果存在酶切位點的變化，就會產(chǎn)生長度不同的DNA片段，電泳后用克隆探針檢測時，就會出現(xiàn)泳動行為的改變。根本過程：取得DNA樣本——酶切——電泳——轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上——DNA探針雜交——放射自顯影RFLP的等位基因其有共顯性特點。RFLP標記位點數(shù)量不受限制，通常可檢測到的基因座位數(shù)為1—4個。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實驗操作較繁鎖，檢測周期長，本錢費用也很高。自RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應(yīng)用。PCR—RFLP如果多態(tài)性位點周圍的DNA序列，那么可用PCR快速而簡單地進行RFLP分析。首先根據(jù)多態(tài)位點兩側(cè)序列設(shè)計和合成引物；以基因組DNA為模板進行PCR擴增；用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行消化；再進行電泳，分析PCR區(qū)帶判斷多態(tài)性。2、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)

數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列又稱小衛(wèi)星DNA(MinisatelliteDNA)，是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10一10001不等。VNTR根本原理與RFLP大致相同，只是對限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點必須不在重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，那么可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關(guān)序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。3、隨機擴增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)RAPD技術(shù)是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術(shù)開展的檢測DNA多態(tài)性的方法。根本原理：它是利用隨機引物〔一般為8—10bp〕通過PCR反響非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所使用的引物各不相同，但對任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結(jié)合位點，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DAN片段插人、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區(qū)域DNA多態(tài)性，但利用一系列引物那么可使檢測區(qū)域擴大到整個基因組，因此，RAPD可用于對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，也可用于構(gòu)建基因組指紋圖譜。與RFLP相比，RAPD具有以下優(yōu)點：(1)技術(shù)簡單，檢測速度快；(2)RAPD分析只需少量DNA樣品；(3)不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)，一套引物可用于不同生物基因組分析；(4)本錢較低。但RAPD也存在一些缺點：RAPD標記是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；(2)存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段；(3)RAPD技術(shù)中影響因素很多，所以實驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。4、任意引物PCR(ArbitrarilyPrimedPolymeraseChainReaction，AP—PCR)在AP—PCR分析中，所使用的引物較長(10－50bp)，PCR反響分為兩個階段，首先寡核昔酸引物在低嚴謹條件下與模板DNA退火，此時發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。然后進行高嚴謹退火條件的循環(huán)，兩個位點間那些序列在低嚴謹度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴謹條件下擴增。采用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，最終反響結(jié)果與RAPD類似。只要設(shè)計的引物在低嚴謹退火條件下能減少引物產(chǎn)生人為產(chǎn)物，應(yīng)用成對組合的引物可以產(chǎn)生新的AP—PCR譜帶，但引物配對組合使用時，得到的圖譜與單引物單獨使用時產(chǎn)生的圖譜之和很不相同，這樣，50個引物能產(chǎn)生1250種不同指紋圖譜。AP—PCR方法不需預(yù)知序列資料，而且檢測的基因組樣本是任意的，還能夠用于檢測近等基因系(或同類系)中的多態(tài)性。AP—PCR的缺點是每個新的多態(tài)性都必須經(jīng)純化才能進一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可區(qū)分長度多態(tài)性。5、DNA擴增指紋印跡(DNAAmplificationFingerprinting，DAF)DAF是一種改進的RAPD分析技術(shù)，與RAPD技術(shù)不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長度更短(一般為5一8bp)，因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當使用5個核昔酸的引物時，引物和模板的組合大約可擴增出10一100個DNA片段。PCR擴增產(chǎn)物是在凝膠上進行別離，通過銀染即可產(chǎn)生非常復(fù)雜帶型。6、序列標志位點(SequenceTaggedSites，STS)STS是對以特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統(tǒng)稱。通過設(shè)計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結(jié)合位點結(jié)合，從而可用來擴增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。利用特異PCR技術(shù)的最大優(yōu)點是它產(chǎn)生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模糊性。7、簡單重復(fù)序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)簡單重復(fù)序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1一6bp，其中最常見是雙核昔酸重復(fù)，即(CA)n和(TG)n每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10一60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標記的根本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設(shè)計引物，通過PCR反響擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)別離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。SSR具有以下一些優(yōu)點：(l)一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；(2)微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；(3)所需DNA量少。顯然，在采用SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋那么首先必須對其進行測序。8、序列特異性擴增區(qū)(Sequence—characterizedAmplifiedRegion，SCAR)SCAR標記是在RAPD技術(shù)根底上開展起來的。SCAR標記是將目標RAPD片段進行克隆并對其末端測序，根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計特異引物，對基因DNA片段再進行PCR特異擴增，把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒別出來。SCAR標記是共顯性遺傳，待檢DNA間的差異可直接通過有無擴增產(chǎn)物來顯示。SCAR標記方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。9、單引物擴增反響(SinglePrimerAmplificatipnReaction，SPAR)SPAR技術(shù)是與RAPD技術(shù)相似的一種標記技術(shù)，SPAR也只用一個引物，但所用的引物是在SSR的根底上設(shè)計的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進行特異性結(jié)合，然后通過P(：R技術(shù)擴增SSR之間的DNA序列，凝膠電泳別離擴增產(chǎn)物，分析其多態(tài)性。另外，還有一種與SPAR技術(shù)非常相似的標記技術(shù)，即ISTR(InverseSequence—taggedRepeat)技術(shù)，ISTR所用的引物是在反向重復(fù)序列根底上設(shè)計的，PCR擴增的是反向重復(fù)序列之間的DIVA序列。10、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP)SSCP是指等長的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產(chǎn)生構(gòu)象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現(xiàn)為電泳遷移率的差異。單鏈DNA構(gòu)象分析對DNA序列的改變非常敏感，常常一個堿基差異都能顯示出來。在SSCP分析中，利用PCR技術(shù)定點擴增基因組DNA中某一目的片段，將擴增產(chǎn)物進行變性處理，雙鏈DNA分開成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳別離，根據(jù)條帶位置變化來判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結(jié)果判定是通過多個樣品之間比照，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個體的DNA特異性，到達指紋分析目的。為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結(jié)合。其中與雜交雙鏈分析(Heterocluplexanalysis，Het)法結(jié)合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進行雜交，含有一對堿基對錯配的雜交鏈可以和完全互補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被別離開。對同一靶序列分別進行SSCP和Het分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便。11、雙脫氧化指紋法(DideoxyFingerprints，ddF)ddF是將雙脫氧末端終止測序法與SSCP結(jié)合起來的分析技術(shù)，對由雙脫氧末端終止的長短不一的單鏈DNA進行SSCP分析。如果目的片段存在一個突變，那么所有大于某一大小對應(yīng)于突主變位置的雙脫氧終止片段無野生型系統(tǒng)，對于每一個突有屢次時機檢測其遷移率改變，提高了檢測突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時因DNA長度影響SSCP顯示的困難，通過一種雙脫氧核昔酸生產(chǎn)特異性的單鏈DNA，使其中長度適宜的DNA片段顯示SSCP改變。12、擴增片段長度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos開展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其根本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反響的模板DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預(yù)擴增，最后在接頭互補鏈的根底上添加1—3個選擇性核苷酸作引物對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳別離檢測獲得的DNA擴增片段，根據(jù)擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。引物由三局部組成：與人工接頭互補的核心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識別序列、引物3’端的選擇堿基序列〔1—10bp〕。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列為結(jié)合位點。該技術(shù)的獨特之處在于所用的專用引物可在知道DNA信息的前提下就可對酶切片段進行PCR擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個限制性內(nèi)切酶，一個酶為多切點，另一個酶切點數(shù)較少，因而AFLP分析產(chǎn)生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點，具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點。但它的技術(shù)費用昂貴，對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。盡管AFLP技術(shù)誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術(shù)的又一次重大突破，被認為是目前一種十分理想、有效的分子標記。13、酶切擴增多態(tài)性序列(CleavedAmplifiedPolymorphismSequences，CAPS)CAPS技術(shù)又稱為PCR—RFLP，它實質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的根本原理是利用己知位點的DNA序列資源設(shè)計出一套特異性的PCR引物(19—27bp〕，然后用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴增產(chǎn)物，凝膠電泳別離酶切片段，染色并進行RFLP分析。GAPS標記揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標記，其優(yōu)點是防止了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可與擴增DNA酶切，所以檢測到多態(tài)性時機較大。14、核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)SNP標記是美國學(xué)者LanderE于1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異。人類基因組大約每1000bpSNP出現(xiàn)一次，已有2000多個標記定位于人類染色體，對人類基因組學(xué)研究具有重要意義。檢測SNP的最正確方法是DNA芯片技術(shù)。SNP被稱為第三代DNA分子標記技術(shù)，隨著DNA芯片技術(shù)的開展，其有望成為最重要最有效的分子標記技。分子標記的應(yīng)用領(lǐng)域1、基因組作圖和基因定位研究長期以來，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據(jù)諸如形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標記來構(gòu)建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數(shù)種類的生物，而且圖譜分辨率大多很低，圖距大，飽和度低，因而應(yīng)用價值有限。分子標記用于遺傳圖譜構(gòu)建是遺傳學(xué)領(lǐng)域的重大進展之一。隨著新的標記技術(shù)的開展，生物遺傳圖譜名單上的新成員將不斷增加，圖譜上標記的密度也將越來越高。建立起完整的高密度的分子圖譜，就可以定位感興趣的基因。2、基于圖譜克隆基因圖位克隆(Map—bascdcloning))是近幾年隨著分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分