超氧化物歧化酶的研究進展

超氧化物歧化酶的研究進展

氧化還原反應是生命最重要的代謝途徑。它不僅能為生物提供能量，還決定著生命的衰老和死亡。氧對于生命活動極其重要,但氧參與的代謝經(jīng)常產(chǎn)生一些對細胞有毒害作用的副產(chǎn)物———氧自由基,即通常所說的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)。細胞產(chǎn)生的活性氧包括:超氧根陰離子(O2·-)、氫氧根離子(OH-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(·O2)和過氧化物自由基(ROO·)。它們都能通過氧化應激損傷細胞大分子,引起一系列有害的生化反應,造成蛋白質損傷、脂質過氧化、DNA突變和酶失活等。為了防止氧自由基對細胞體的破壞,幾乎所有細胞都有一套完整的保護體系,來清除細胞新陳代謝產(chǎn)生的各種活性氧。其中,超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)在保護細胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用。早在1969年,McCord和Fridovich發(fā)現(xiàn)了一種血球銅蛋白能清除自由基(O2·-),并且將這種血球銅蛋白命名為超氧化物歧化酶(SOD)。SOD幾乎存在于所有生物細胞中,通過把O2·-轉化為H2O2,H2O2再被過氧化氫酶和氧化物酶轉化為無害的水(H2O),從而達到清除細胞內氧自由基,保護細胞的目的。超氧化物歧化酶的來源有很多種,動物、植物和微生物中都提取。其在食品、醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)方面表現(xiàn)出很大的應用潛力,本文從SOD來源和應用的角度綜述了SOD的研究進展。1金屬輔因子的價值流變SOD是一種重要的抗氧化劑,保護暴露于氧氣中的細胞。其能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫主要通過以下兩步完成:這里M代表金屬輔因子,M3+代表金屬輔因子的最高價,M2+代表金屬輔因子被氧化以后的價位。這種逐步遞增機制從反應動力學來說,具有如下優(yōu)點:首先,一個分子反應能克服兩個分子同時反應之間產(chǎn)生的靜電排斥作用,且?guī)д姾傻幕钚越饘偬禺愋越Y合帶副電荷的超氧陰離子(O2·)。其次,活性位點的金屬離子靜電引力被一個質子吸收并保存,在這種機制中,歧化反應的產(chǎn)物是中性的,不互相約束。第三,第一步反應釋放的能量能提供給第二步來還原超氧陰離子(O2·),然后H2O2再被過氧化氫酶還原成H2O。2sod分類及其生產(chǎn)方法2.1cu/zn-sod和fe-sodSOD時刻清除細胞內新陳代謝等過程中產(chǎn)生的氧自由基。所有SOD催化中心都包含有一個金屬離子,根據(jù)金屬離子的不同,SOD家族可以分為四種:Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和NiSOD。在20億年前,SOD在原核生物中出現(xiàn)兩類:Cu/Zn-SOD和Fe/Mn-SOD。隨著基因的進化,Fe/Mn-SOD逐漸演變?yōu)镕e-SOD和Mn-SOD,三維機構和氨基酸序列卻依然非常接近。然而Cu/Zn-SOD和Fe-SOD,Mn-SOD在晶體結構和催化機制上都表現(xiàn)出非常大的差異,這也從側面支持獨立進化的假說。Cu/Zn-SOD主要存在于真核細胞質、葉綠體和細菌細胞質、周質空間中。在細菌、植物和動物中,Cu/Zn-SOD的編碼基因不盡相同。Mn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的線粒體中。Fe-SOD存在于原核生物和少數(shù)植物中。在原核生物和植物葉綠體中編碼Fe-SOD的基因序列相似性很高。許多古生菌來源的Fe-SOD和Mn-SOD都極端耐熱(很多最適生長溫度超過40℃),推測它們起源于物種形成的早期。而且,這些極端嗜熱SOD可以在很寬的溫度范圍(包括室溫)內發(fā)揮催化活性。從生化角度分析,較高的Tm值以及寬泛的催化溫度可以使這些酶以準凍結狀態(tài)存在,在反應過程中無需較大的構象變化,而且很容易適應中溫環(huán)境,并在中溫環(huán)境下發(fā)揮活性。迄今為止,只在鏈霉菌屬和藍細菌中發(fā)現(xiàn)有Ni-SOD的存在,對Ni-SOD的研究也相對較少。杜邦公司利用公共數(shù)據(jù)庫分析了它們的序列,發(fā)現(xiàn)這些Ni-SOD大多存在于海洋生物之中。2.2發(fā)酵生產(chǎn)過程中sod的提取目前SOD的生產(chǎn)方式主要有四種:①利用動物血液提取法,這是20世紀90年代以前最常用的方法。這種方法存在交叉感染和過敏性反應等風險,歐盟已于1999年頒布法令,禁止從動物血液中提取的SOD用于人類的醫(yī)療和保健。②從植物中提取。現(xiàn)已報道分別從大蒜、桑葉、沙棘、仙人掌、玉米和大豆中成功提取獲得SOD。其提取方法主要有分步鹽析法、有機溶劑沉淀法和層析法等。但植物中SOD含量較少,提取工藝相對復雜,這就使得SOD生產(chǎn)成本相對較高。③微生物發(fā)酵法生產(chǎn)SOD。選育SOD高產(chǎn)菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)一種是比較有效的方法,1997年,王歲樓等利用常規(guī)篩選方法自然篩選出1株SOD高產(chǎn)菌株,酶活可達600U/g濕菌體,為SOD的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)打下了基礎。吳思方等研究了從啤酒廢酵母生產(chǎn)、提取和純化SOD的方法及條件,得到比活為3048U/mg的SOD。微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)SOD,不僅產(chǎn)量高,而且提取工藝簡單,因而能大幅度降低SOD的生產(chǎn)成本。由于SOD來源有限,異體蛋白免疫原性,受溫度和pH等影響不穩(wěn)定性,在應用方面也會有很大限制。④基因工程法是獲得應用所需要SOD產(chǎn)品有效途徑。近年來,美國、日本、英國和德國相繼開發(fā)了微生物基因工程產(chǎn)品,并進行了臨床實驗。施惠娟等分別以人胎肝組織及人肝細胞株(L02)總RNA為模板,以RT-PCR法獲得hCu/Zn-SOD和hMn-SODcDNA,構建表達質粒pETSOD,并導入E.coil細胞中使之表達,分別獲得了38%和50%的高表達率且有活性。目前,國內外在基因工程生產(chǎn)SOD方面均取得了可喜的成果。3超氧化物誘導酶的應用潛力3.1保持體內od含量的意義正常健康機體內自由基的形成和清除處于一種動態(tài)平衡中,但隨著年齡的增長,體內SOD的含量呈下降趨勢,相應的,增長的自由基會破壞機體的平衡,使機體產(chǎn)生各種疾病。所以,保持體內適量的SOD是維護健康和延緩衰老的有效途徑。根據(jù)這一原理,作為自由基清除劑之一的SOD現(xiàn)已被用于臨床治療研究,并取得一定的效果(表1)。3.2關于sod的應用SOD在食品工業(yè)上的應用一直存在爭論,主要有兩方面的疑問:一是SOD作為生物大分子如何通過細胞屏障進入到人體內;二是SOD化學本質為蛋白質,通過口服流經(jīng)腸胃時會不會被蛋白酶類降解和破壞。Marinv和Pastori利用口服SOD治療睪丸變性,結果表明服用SOD的90名患者均疼痛感消失,且大部分人的性功能有所恢復。Bernier等對小鼠口服SOD治療局部缺血再灌注引起的心室纖維性顫動進行了研究,發(fā)現(xiàn)口服SOD后,纖維性顫動的發(fā)生率由對照組的87%降到27%。這兩個實驗能間接的證明,SOD口服能起到一定的作用。但要從科學的角度來解決上述兩個問題,得通過相應的實驗來證明。關于第一個觀點,現(xiàn)在還沒有科學的論斷,部分學者認為,口服SOD后,SOD在胃腸道降解成小分子進入血液循環(huán),因為通過熒光標記實驗,可以在血液中檢測出來。另一方面,SOD降解后的一些小肽段能穿過細胞膜,也許這些小肽段也有部分的SOD活性。關于第二個觀點,胃酸pH在1~2.5左右,SOD經(jīng)灌胃后能夠耐受胃腸道中酸解和酶解作用,有50%左右的SOD以活性形式存留下來,為SOD的吸收提供了前提條件。SOD在食品中應用相對于醫(yī)藥應用來說比較簡單,之前SOD不能大規(guī)模應用于食品工業(yè),可能在于不同來源的SOD本身穩(wěn)定性的差異。從動物、植物或者一般的微生物里提取出來的SOD穩(wěn)定性較差,不能耐高溫和酸。要想把各種來源的SOD做成食品,需要對SOD本身及載體進行改造,例如,口服SOD的時候同時服用酶抑制劑,應用膜透過促進劑,脂質體和微囊包埋等。另一方面,也可以從SOD的來源著手,中國科學院微生物所從極端環(huán)境中篩選到一種產(chǎn)耐熱SOD的菌株,該SOD能耐高溫,耐酸耐堿,穩(wěn)定性強,在食品工業(yè)中可以有很好的突破。3.3植物抗氧化活性SOD與植物生物和非生物脅迫抗性有很重要的關系。通過對水稻、狹葉羽扇豆、煙草等的研究結果看,在鹽害環(huán)境下SOD活性升高。國外對小麥斑點病、黃瓜霜霉病、棉花黃萎病等也進行了研究,結果顯示,凡感染病害的植株體內SOD活性都有所增強。光調節(jié)的發(fā)育過程包括發(fā)芽、莖的生長、葉和根的發(fā)育、向光性、葉綠素的合成、分枝及花的誘導等。在對紅樹林的研究中發(fā)現(xiàn),3d的暗培養(yǎng)并沒有使SOD的表達量發(fā)生變化,而7d暗培養(yǎng)后SODmRNA表達量明顯下降。無論SOD活性升高或是降低、表達量增加還是減少,都會發(fā)現(xiàn)活性高的與表達量高的株系抗性較強。SOD的表達量高低與活性的強弱都直接決定了植物的抗逆性。SOD在植物基因工程中的應用廣泛受到科研工作者的關注和重視,試圖通過轉SOD基因技術來培育高抗逆農(nóng)作物新品種已成為國內外研究熱點之一。2002年克隆出了桃的MnSOD基因。2006年希臘克隆出了棉花的Cu/ZnSOD基因。我國也克隆出了水稻的FeSOD基因,并且原核表達出了有活性的蛋白。這些研究都為利用培育高抗性的轉基因植物提供了堅實的基礎。4加入sod的生物生態(tài)學特性SOD已在食品、醫(yī)藥保健品以及農(nóng)業(yè)上展現(xiàn)了巨大的功能價值,特別是在當前地球環(huán)境日益惡化的情況下,各種來源的食品、飲用水等都因為環(huán)境污染和惡化,造成大量氧自由基的產(chǎn)生,而這種失衡的過量氧自由基對人體健康會產(chǎn)生一系列影響,會間接性誘發(fā)各種癌癥、炎癥和糖尿病等的高發(fā),因此,通過在食品中加入適量SOD,或補充食入適量的SOD,可以有效調節(jié)和降低食品中及機體中過量的氧自由基的積累,從而能夠有效保護人體細胞不受到過量氧自由基的破壞,延緩細胞的衰老過程,最終使人的生命得到健康延壽。目前國內外大量臨床實驗證明口服SOD也能夠在機體中發(fā)揮SOD抗衰老和抗病治療的作用,同位素示蹤實驗表明,人體可能通過一些特殊的消化吸收機制,使得一定量的具有SOD進入人體中,發(fā)揮其功能,但這類吸收機制的原理還有待