土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

課題背景尿素[CO(NH2)2]——重要的農業(yè)氮肥。只有被土壤中細菌分解為NH3才能被植物吸收利用脲酶CO(NH2)2+H2OCO2+2NH31整理課件課題2土壤分解尿素的細菌的別離與計數(shù)1.從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌

2.統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌課題目的2整理課件一、研究思路(一)篩選菌種1實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶啟示：PCR技術：要求使用耐高溫〔930C〕的DNA聚合酶。尋找目的菌種時要根據它對_______________，到相應的環(huán)境中去尋找。生存環(huán)境的要求耐高溫的酶耐高溫生物體耐高溫環(huán)境〔熱泉、火山口〕尋找尋找Taq細菌篩選原因:因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的Taq細菌保存下來。3整理課件2實驗室中微生物的篩選原理

人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。思考：

該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素4整理課件

此配方能否篩選出產生脲酶的細菌？為什么？原那么上能。只有產生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生存。3選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，將允許______________________，同時_________________________生長的培養(yǎng)基。特定種類的微生物生長抑制或阻止其他種類微生物結果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過稀釋涂布平板等方法對它進行純化培養(yǎng)別離。5整理課件如何對細菌進行計數(shù)？1顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板〕，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。6整理課件2稀釋涂布平板法〔間接計數(shù)〕1011021031041051067整理課件(二)統(tǒng)計菌落數(shù)目方法

運用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)。原理

1個菌落←1個活菌①選擇菌落數(shù)在30～300的平板上計數(shù)。②需培養(yǎng)計算出三個或三個以上的平板菌落求平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。本卷須知8整理課件看課本P22，并討論你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？

第一位同學：沒有重復實驗〔至少涂布3個平板〕第二位同學：A組結果誤差過大，不應用于計算平均值9整理課件計算公式：某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是〔涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml〕()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B每克樣品中的菌株數(shù)=〔C÷V〕×M10整理課件(三)設置對照實驗閱讀P22～23頁“〔三〕設置對照〞一段討論教材中提出的問題。設置對照的目的：排除實驗組中非測試因素對試驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。(1)A同學出現(xiàn)此結果的可能原因？⑴土樣不同⑵培養(yǎng)基污染(或混入了其他的含氮物質)11整理課件(2)設置對照實驗，幫助A同學排除上述兩個可能影響實驗結果的因素？這個實例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，那么證明______；如果結果不同，那么證明A同學存在____________________________A無誤培養(yǎng)基的配制有問題。12整理課件實驗流程：樣品稀釋涂布平板微生物的培養(yǎng)與觀察

菌落計數(shù)二、實驗設計土壤取樣制備培養(yǎng)基13整理課件〔一〕土壤取樣從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中?！拔⑸锏奶烊慌囵B(yǎng)基〞數(shù)量最大、種類最多大約70%—90%是細菌14整理課件〔二〕制備培養(yǎng)基制備選擇培養(yǎng)基〔尿素為唯一氮源〕制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用?！矊φ兆饔谩乘伎?？為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？15整理課件〔三〕樣品稀釋涂布平板稀釋倍數(shù)為101～106。每個稀釋度均用3個選擇培養(yǎng)基和1個蛋白胨培養(yǎng)基。16整理課件〔四〕微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間缺乏而導致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。

細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d

放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d

霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。17整理課件不同種類的細菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據。18整理課件菌落19整理課件菌落20整理課件[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]制定方案三、操作提示21整理課件四、結果分析與評價1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？

對照的培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目多余選擇培養(yǎng)基的菌落數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。22整理課件四、結果分析與評價2.獲得某一稀釋度下，菌落數(shù)30～300的平板，在這以稀釋度下是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相接近？

相接近，說明操作成功。23整理課件五、課題延伸1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中參加酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。2.測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅-美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記算得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。24整理課件本課題知識小結:25整理課件穩(wěn)固練習1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是〔〕A.培養(yǎng)細菌B.培養(yǎng)真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素CD26整理課件3.以下說法不正確的選項是〔〕A.科學家從70－80度熱泉中別離到耐高溫的TaqDNA聚合酶。B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計