DNA重組及重組DNA技術(shù)

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重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnology)：

又稱分子克隆或DNA克隆或基因工程技術(shù)，其主要過程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又稱載體）連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。在克隆目的基因后，還可針對該基因進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)或多肽的制備以及基因結(jié)構(gòu)的定向改造。特點(diǎn)

分子水平操作和細(xì)胞水平表達(dá)定向地改造生物的遺傳性狀，

獲得人類所需要的品種

克隆特定基因表達(dá)特定基因，產(chǎn)生蛋白質(zhì)建立基因文庫建立cDNA文庫進(jìn)行DNA測序克隆(clone)

是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。重組DNA技術(shù)的目的操作過程可形象歸納為分─目的DNA的分離獲取選─載體的選擇與構(gòu)建接─目的DNA與載體的連接轉(zhuǎn)─重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩─重組體的篩選與鑒定載體雙酶切產(chǎn)生粘性末端目的基因帶有與載體相同粘性末端重組DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)對克隆菌進(jìn)行篩選、鑒定和擴(kuò)增目的基因的表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的提取與純化含重組載體的細(xì)菌重組DNA技術(shù)操作流程圖重組DNA技術(shù)的基本原理和操作步驟

（一）目的DNA的分離獲取——分（二）載體的選擇與構(gòu)建——選化學(xué)合成法從染色體中直接分離反轉(zhuǎn)錄合成ｃDNA構(gòu)建基因組DNA文庫和cDNA文庫聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（一）目的DNA的分離獲取——分目的DNA是指所要研究或應(yīng)用的基因。也是需要克隆或表達(dá)的基因1.對已知短鏈多肽，根據(jù)基因的核苷酸序列或按編碼轉(zhuǎn)換成核苷酸序列→人工合成(DNA合成儀)。2.對于大分子多肽，首先分為幾個片段進(jìn)行合成→再合成有缺口的雙鏈→最后用連接酶連接。例：由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列氨基酸序列色trp色苯丙phe苯丙蛋met蛋賴lys賴ACCAAGTACT

T

TACCAAATACT

T

TACCAAGTACT

TCACCAAATACT

TC可能的DNA序列說明：由于密碼存在簡并性，合成出來的DNA可能與基因組DNA有所差異，此問題可通過基因測序解決。如果是為了獲得表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)，這種差異也無所謂。一、化學(xué)合成法特別適合于低等生物(物理圖譜已確定、背景資料清楚)。因原核

生物基因組、噬菌體、DNA病毒基因組比較小，且基因間無間隔序列。從受體菌中篩選克隆載體導(dǎo)入受體菌基因組DNA限制性內(nèi)切酶消化重組DNA分子二、從染色體中直接分離逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA的基本過程12~18個寡聚d(T)片段(引物)AAAAAAAA(n)3

mRNA5

AAAAAAAA(n)3

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cDNA3cDNAT

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逆轉(zhuǎn)錄酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶分離提取特異性蛋白質(zhì)的mRNAcDNA雙鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制說明：這種cDNA中不包含內(nèi)含子，便于在宿主細(xì)胞中表達(dá),適用于真核生物基因。三、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段(n個目的基因)重組DNA分子(n個重組體)

培養(yǎng)、擴(kuò)增得到重組分子的轉(zhuǎn)化菌落混合體(n個)–DNA文庫限制性內(nèi)切酶部分消化克隆載體(n個)引入受體菌(n個)說明：部分消化是指當(dāng)DNA中有兩個或兩個以上相同酶切位點(diǎn)時，通過控制酶的用量和時間，只切斷一個或部分位點(diǎn)。篩選基因組DNA文庫:存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。即所有克隆DNA片段的總和應(yīng)為整個基因組的DNA序列。四、構(gòu)建基因組文庫及cDNA文庫左臂

右臂cosLRcos限制酶部分消化限制酶消化除去中間片段真核生物染色體DNA連接反應(yīng)體外包裝15~25KbDNA片段~20Kb外源DNA片段cosLRcos基因文庫限制酶切位點(diǎn)外源DNA與載體DNA混合cosLRcos

噬菌體DNA用重組噬菌體感染大腸桿菌cDNA文庫是指某種特定細(xì)胞及特定狀態(tài)下的全部cDNA克隆。說明：一個個體所有體細(xì)胞均有相同的基因，但不同種類的組織細(xì)胞或同一細(xì)胞在生長發(fā)育的不同階段，以及所受環(huán)境因素的不同，基因表達(dá)的種類和數(shù)量各不相同,因此只有細(xì)胞內(nèi)存在的mRNA，才能構(gòu)建相應(yīng)的cDNA文庫。cDNA文庫的構(gòu)建對于真核生物可以從cDNA文庫中獲得目的基因：cDNA文庫篩選特定cDNA克隆cDNA片段酶切分離提取mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫克隆載體反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制受體菌方法：1.目的基因的兩端部分序列已知,通過合成適當(dāng)引物,即可擴(kuò)增得到(用于細(xì)胞內(nèi)目的基因少，提取困難)。2.mRNA已知，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法直接從mRNA獲得特定基因的cDNA。

是一種對已知基因的體外特異擴(kuò)增的方法。五、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（二）載體的選擇與構(gòu)建——選載體(vector)

是攜帶目的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具(也是DNA)

?？寺≥d體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。需要復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)志。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體[將常用克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件(DNA序列)。如啟動子、SD序列、終止子]。能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)(外源DNA插入點(diǎn))，常具有多個單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)(MCS)，便于外源基因的插入。如在這些位點(diǎn)有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，便于篩選；分子量小，以容納較大的外源DNA。常用載體有：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、病毒(腺病毒；腺病毒相關(guān)病毒；

痘病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒；猴空泡病毒.)克隆載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒細(xì)菌染色體質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的具有自主復(fù)制能力的小型環(huán)狀雙螺旋DNA分子，其分子變化相當(dāng)大。

特點(diǎn)：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀，以便識別質(zhì)粒的存在。

一、質(zhì)粒（plasmid)依據(jù)復(fù)制調(diào)節(jié)的嚴(yán)密性嚴(yán)緊型：只隨細(xì)菌染色體復(fù)制，每個細(xì)胞只含1~5個拷貝。松弛型：自主復(fù)制，每個細(xì)胞含10~200個拷貝。噬菌體按生活周期分溶菌性溶源性用于克隆載體的噬菌體

噬菌體雙鏈?zhǔn)删wM13噬菌體單鏈?zhǔn)删w頭部尾尾部纖維蛋白衣殼DNA

感染細(xì)菌后將自身的DNA整合到細(xì)菌的染色體中，和細(xì)菌染色體一起復(fù)制。

感染細(xì)菌后連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放出噬菌體再感染其它細(xì)菌。二、噬菌體(phage)溶菌性噬菌體溶源性噬菌體主要有

gt系列(插入型,克隆容量7kb,適用cDNA克隆)EMBL系列(置換型,克隆容量9~23kb,適用基因組克隆)EMBL系列21kb13kb10kbSalⅠBamHⅠEcoRⅠSalⅠBamHⅠEcoRⅠ44kbEMBL344kbEMBL4SalⅠBamHⅠEcoRⅠSalⅠBamHⅠEcoRⅠ有外源DNA插入––可包裝無外源DNA插入––不能包裝1.噬菌體DNA改造系統(tǒng)

gt10和

gt11結(jié)構(gòu)簡圖BglⅡBamHⅠBamHⅠXh0ⅠSmaⅠHindⅢA：

gt10右臂0.032.743.3kb左臂λCIHindⅢSmaⅠBamHⅠHindⅢSmaⅠBglⅡBamHⅠEcoRⅠBglⅡBamHⅠ遺傳標(biāo)志有外源DNA插入––透明噬菌斑無外源DNA插入––混濁噬菌斑KpnⅠPvuⅠB：

gt11左臂右臂0.043.7kb19.6LacZBamHⅠKpnⅠEcoRⅠSstⅠPvuⅠXbaⅠSstⅠHindⅢBamHⅠXh0ⅠBamHⅠPvuⅠHindⅢHindⅢ遺傳標(biāo)志有外源DNA插入––白色噬菌斑無外源DNA插入––藍(lán)色噬菌斑2.M13噬菌體

M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，單鏈閉合環(huán)狀DNA，長約為6.5kb，只能感染雄性大腸桿菌，進(jìn)入大腸桿菌后復(fù)制成雙鏈的復(fù)制型DNA(RFDNA)，RFDNA可作為克隆載體。M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列LacDNA6.5kb多克隆位點(diǎn)(含Lac啟動子-操縱基因和

-半乳糖苷酶基因