DNA雙鏈斷裂和同源重組修復(fù)的研究進(jìn)展

DNA雙鏈斷裂與同源重組修復(fù)的研究進(jìn)展DNA雙鏈斷裂（DSB）是細(xì)胞受到電離輻射后最嚴(yán)重的DNA損傷，造成細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯以及DNA損傷修復(fù)。DNA損傷發(fā)生后，激活細(xì)胞內(nèi)DNA損傷應(yīng)答，啟動(dòng)DSB修復(fù)通路同源重組（HR）和非同源重組末端連接（NHEJ）。HR修復(fù)分為聯(lián)會(huì)前期、聯(lián)會(huì)期和聯(lián)會(huì)后期，以姐妹染色單體為模板，進(jìn)行無錯(cuò)誤修復(fù)，是保護(hù)基因組完整性的重要機(jī)制。對(duì)IR造成的DSBHR和NHEJ含有互補(bǔ)關(guān)系，G2和S期HR是重要修復(fù)方式。HR是腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，合成致死是HR用于腫瘤靶向治療的重要機(jī)制。本文重要對(duì)DSB修復(fù)過程中所涉及HR修復(fù)通路中的分子機(jī)制、合成致死概念及其與NHEJ修復(fù)的關(guān)系作一綜述，并探討其成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究和潛在臨床應(yīng)用的可能性。標(biāo)簽：DNA雙鏈斷裂；同源重組；非同源末端連接；合成致死；轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究DNA雙鏈斷裂（DNAdoublestrandsbreakage，DSB）是細(xì)胞受到電離輻射后生物學(xué)上最嚴(yán)重的損傷。DNA損傷激活細(xì)胞內(nèi)DNA損傷應(yīng)答（DNAdamageresponse，DDR），產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯以及DNA損傷修復(fù)等一系列生物學(xué)效應(yīng)。DSB修復(fù)有同源重組（Homologousrecombination，HR）和非同源重組末端連接（Non-homologousend-joining，NHEJ）修復(fù)兩種方式。本文著重介紹HR修復(fù)分子機(jī)制、影響因素、合成致死及其與NHEJ修復(fù)的關(guān)系，并探討其臨床應(yīng)用的潛在可行性。DNA損傷啟動(dòng)多個(gè)修復(fù)機(jī)制，其中HR修復(fù)是保護(hù)基因組完整性的重要機(jī)制，參加DNA單鏈斷裂（Singlestrandbreakage，SSB）造成的復(fù)制叉斷裂和鏈間交聯(lián)以及DSB的修復(fù)，以姐妹染色單體為DNA模板，是無錯(cuò)誤修復(fù)通路，只發(fā)生在S期和G2期[1]。放射生物學(xué)家們從20世紀(jì)早期已著手HR修復(fù)與DSB的關(guān)系的研究，本文僅以時(shí)間點(diǎn)為線索回想HR修復(fù)和合成致死的重要研究進(jìn)展，詳見圖1。1同源重組修復(fù)機(jī)制、影響因素及其合成致死效應(yīng)HR修復(fù)的重要成分涉及MRN（MRE11–RAD50–NBS1）復(fù)合體，RAD51、RAD51同源異構(gòu)體、RAD52（在酵母菌中）、RAD54，涉及BRCA1、CtIP（CtBPinteractingprotein）、ATM、ATR、PALB2（PartnerandlocalizerofBRCA2）、BRIP1（BRCA1interactingproteinC-terminalhelicase1）等因子[1-2]。1.1HR修復(fù)機(jī)制HR修復(fù)分為3個(gè)時(shí)期：（1）聯(lián)會(huì)前期；（2）聯(lián)會(huì)期；（3）聯(lián)會(huì)后期[1-3]。1.1.1聯(lián)會(huì)前期MRN復(fù)合體與DNA斷端結(jié)合啟動(dòng)HR修復(fù)，Mre11與CtIP啟動(dòng)5’-3’切除過程[4]。核酸外切酶1和含有解螺旋酶-核酸內(nèi)切酶功效的STR-Dna2復(fù)合體共同作用持續(xù)產(chǎn)生ssDNA。RPA覆蓋切除的DNA斷端，限制二級(jí)構(gòu)造形成，增進(jìn)RAD52介導(dǎo)的重組酶RAD51裝載。RAD51在ssDNA上形成前聯(lián)會(huì)核蛋白纖維[1，3]。1.1.2聯(lián)會(huì)期RAD51-ssDNA聯(lián)會(huì)前核蛋白纖維介導(dǎo)同源序列的尋找和DNA鏈侵入，這是HR修復(fù)核心反映。靶DNA與RAD51核蛋白纖維之間的DNA鏈配對(duì)形成D-loop，涉及新異源雙鏈DNA和供體DNA移位的鏈[3]。RAD54協(xié)助RAD51尋找DNA同源序列、Holliday聯(lián)結(jié)分支的遷移及RAD51取代侵入DNA和啟動(dòng)DNA修復(fù)的過程[5]。1.1.3聯(lián)會(huì)后期以3’-斷端為引物進(jìn)行DNA合成，RAD51與dsDNA分離，暴露DNA合成所需的3’-OH[1]。第二個(gè)DSB斷端與擴(kuò)展的D-loop平行，形成雙Holliday聯(lián)結(jié)，在解離酶作用下這些對(duì)稱構(gòu)造產(chǎn)生交換型或非交換型產(chǎn)物[3]。1.2HR修復(fù)的影響因素HR修復(fù)受RAD51、BRCA1、BRCA2等因子調(diào)控。BRCA1的腫瘤克制因子活性依賴其細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄、蛋白泛素化、凋亡和DNA修復(fù)方面的功效，受BRCT磷酸蛋白識(shí)別區(qū)域調(diào)節(jié)。Rad50、RAD51和γH2AX的募集過程依賴BRCA1，BRCA1缺失細(xì)胞喪失使RAD51集中于DNA損傷區(qū)域的能力，造成HR和NHEJ修復(fù)、S期和G2-M期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)均存在缺點(diǎn)[5-6]。間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)型（Mesenchymalepithelialtransition，MET）克制劑下調(diào)MET活性，減少RAD51移入細(xì)胞核并阻斷RAD51-BRCA2復(fù)合體之間互相作用，致HR修復(fù)受損，γH2AX消退延遲，細(xì)胞內(nèi)DSB持續(xù)高水平[7]。CDK1、2（Cyclindependentkinase1，2）磷酸化BRCA2，調(diào)節(jié)其與RAD51互相作用，增進(jìn)S/G2期HR修復(fù)[8]?？傊?，HR修復(fù)是眾多因子共同作用互相協(xié)調(diào)的過程，這些因子失活或環(huán)節(jié)中斷都會(huì)對(duì)HR修復(fù)的最后效應(yīng)產(chǎn)生影響。1.3合成致死合成致死（Syntheticlethality）指2個(gè)或以上基因同時(shí)突變的遺傳組合造成細(xì)胞死亡，而這些基因中任意一種基因突變都不會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡。HR修復(fù)缺點(diǎn)腫瘤細(xì)胞中常見BRCA1和BRCA2等基因突變，此背景下應(yīng)用特異性靶向藥品克制特定基因體現(xiàn)，產(chǎn)生合成致死效應(yīng)。其治療方略意義是在DNA損傷修復(fù)缺點(diǎn)腫瘤細(xì)胞中克制其它修復(fù)通路增進(jìn)合成致死效應(yīng)；也可克制預(yù)先存在細(xì)胞周期檢查點(diǎn)缺點(diǎn)或修復(fù)缺點(diǎn)細(xì)胞的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，增加損傷DNA聚集和增進(jìn)細(xì)胞死亡[9]。2HR修復(fù)與NHEJ修復(fù)的關(guān)系對(duì)IR所致的DSBHR與NHEJ修復(fù)含有互補(bǔ)作用。一種決定修復(fù)方式的重要因素是5’-3’DNA斷端切除，啟動(dòng)NHEJ修復(fù)失敗后進(jìn)行，增進(jìn)HR修復(fù)而非典型NHEJ修復(fù)。53BP1阻斷斷端切除克制HR修復(fù)，是核心調(diào)節(jié)因子[10]。DDR因子E3泛素連接酶RNF168增進(jìn)刪除BRCA1的細(xì)胞中H2A/H2AX在K13/15單泛素化和53BP1聚集在損傷區(qū)域，克制HR修復(fù)[11]。HR修復(fù)缺點(diǎn)細(xì)胞中，易產(chǎn)生錯(cuò)誤的NHEJ修復(fù)是重要修復(fù)方式，染色體易位和重組的頻率增加。G2期兩條通路都有效時(shí)，優(yōu)先選擇不易產(chǎn)生錯(cuò)誤的HR修復(fù)[12]。3HR修復(fù)研究的潛在臨床意義DSB修復(fù)異常作為腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，近年來受到廣泛關(guān)注和研究。3.1HR修復(fù)與疾病發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系BRCA1N端RING構(gòu)造域和C端BRCT構(gòu)造域的遺傳性變異對(duì)易造成遺傳性乳腺癌和卵巢癌[13]。BRCA1特定位點(diǎn)錯(cuò)義突變或氨基酸置換影響HR修復(fù)和SSA（single-strandannealing）修復(fù)，是遺傳性乳腺癌致病因素[14]。BRCA1與50%～85%乳腺癌和15%～45%卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。BRCA2是啟動(dòng)BRCA1-BRCA2-HR損傷修復(fù)的效應(yīng)器，其遺傳性缺點(diǎn)與40%～60%乳腺癌和10%～20%卵巢癌終身風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[15]。部分HR修復(fù)通路因子如PALB、BRIP1、BARD1、MUS81、RAD51等，有克制腫瘤活性的功效，在克制乳腺癌和卵巢癌發(fā)病中起重要作用[16]。RAD51低體現(xiàn)見于乳腺癌，高體現(xiàn)見于胰腺癌。MRE11（T）11重復(fù)序列突變見于80%以上結(jié)直腸癌患者中[2]。RAD51家族組員XRCC2缺點(diǎn)時(shí)細(xì)胞內(nèi)HR修復(fù)減少100倍，XRCC2rs3218408與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，rs3218536與乳腺癌和胰腺癌不良預(yù)后有關(guān)[17]。非小細(xì)胞肺癌中RAD51G135C可作為預(yù)測(cè)臨床效果的生物指標(biāo)，攜帶C等位基因患者中位生存率更高；且在吸煙和既往吸煙患者中，攜帶C等位基因患者總生存率較GG基因型患者高[18]。3.2HR修復(fù)與腫瘤靶向治療的研究進(jìn)展3.2.1合成致死的臨床應(yīng)用HR修復(fù)應(yīng)用于腫瘤靶向治療的一種重要機(jī)制是合成致死，常見方略有2種：（1）以特定DNA修復(fù)通路為靶點(diǎn)；（2）細(xì)胞周期檢查點(diǎn)克制劑。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[Poly（adenosinediphosphate（ADP）-ribose）polymerase，PARP]克制劑是重要的合成致死靶向藥品。PARP在修復(fù)SSB中的作用是合成致死的基礎(chǔ)。復(fù)制叉碰到SSB，該損傷轉(zhuǎn)換為DSB，NHEJ不能修復(fù)這類只有一種斷端的DSB，需啟動(dòng)HR修復(fù)；若HR缺點(diǎn)，則無法修復(fù)。PARP克制劑（PARPinhibitor，PARPi）增加開放型SSB，致復(fù)制有關(guān)DSB數(shù)量增加，最后引發(fā)染色單體斷裂和細(xì)胞死亡[9]。BRCA變異細(xì)胞對(duì)PARPi敏感性是野生型細(xì)胞的1000倍，PARPi奧拉帕尼治療乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌顯示出明顯療效[5]。但50%上皮性卵巢癌HR修復(fù)完整，限制PARPi的應(yīng)用。17-AAG將HR修復(fù)完整腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)镠R修復(fù)缺點(diǎn)腫瘤，增加上皮性卵巢癌細(xì)胞對(duì)奧拉帕尼的敏感性[19]。PARPiVeliparib在三陰乳腺癌和化療抗拒的卵巢癌前臨床實(shí)驗(yàn)中顯示單藥活性[2]。Rad52增進(jìn)Rad51介導(dǎo)的HR修復(fù)，BRCA1、PALB2、BRCA2缺點(diǎn)人腫瘤細(xì)胞中刪除RAD52HR修復(fù)速度減緩，染色體異常增加，克隆存活率減少，它們之間存在合成致死關(guān)系。以Rad52為靶點(diǎn)的藥品研發(fā)處在前臨床實(shí)驗(yàn)階段[20]。應(yīng)用細(xì)胞周期檢查點(diǎn)克制劑于DNA修復(fù)缺點(diǎn)細(xì)胞是另一種治療方略。抑癌基因p53為調(diào)控G1/S期檢查點(diǎn)所必需，多個(gè)腫瘤細(xì)胞中失活，特別是BRCA1或BRCA2突變腫瘤細(xì)胞中。ATM-ATR-CHK1通路參加DNA損傷后S和G2期檢查點(diǎn)調(diào)控，CHK1克制劑增加p53突變細(xì)胞對(duì)放射治療或化學(xué)治療敏感性[9]。3.2.2以HR修復(fù)通路因子為靶點(diǎn)的腫瘤治療HR修復(fù)通路重要因子作為腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)已被廣泛研究。近年來出現(xiàn)部分以HR修復(fù)為靶點(diǎn)的抗腫瘤新藥，如：（1）蛋白酶克制劑；（2）Bcl-abl克制劑伊馬替尼；（3）組蛋白乙?；缚酥苿℉istonedeacetylaseinhibitors，HDACi）；（4）熱休克蛋白HSP90克制劑17-AAG。特異性克制劑變化或減少HR修復(fù)通路重要因子功效或活性，克制其修復(fù)能力以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)造成DSB敏感性的目的，此種治療方略已見于前臨床實(shí)驗(yàn)。地西他濱解決多發(fā)性骨髓細(xì)胞激活DDR，增進(jìn)RAD51和53BP1形成，聯(lián)合RAD51克制劑B02增加其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；小劑量HDACiJNJ-26481585干擾DNA損傷修復(fù)通路，提高地西他濱介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[21]。MRN克制劑Mirin制止G2/M期檢查點(diǎn)激活和HR修復(fù)[2]。ATM屬于PIKK超家族，G1-S期ATMS367，S1893，和S1981位點(diǎn)脫磷酸化下調(diào)ATM水平，克制HR修復(fù)[22]，其高度特異性小分子ATP競(jìng)爭(zhēng)性克制劑KU-55933提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線和致DSB藥品的敏感性，提示該藥的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值[2]。刪除特定基因克制HR修復(fù)，增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性，這是含有應(yīng)用前景的增加放射治療敏感性的靶點(diǎn)。研究顯示敲除IGF-1R致HR修復(fù)缺點(diǎn)，γH2AX消除延遲，G1期細(xì)胞放射敏感性增加[23]。黏連蛋白（Cohesin）由SMC1、SMC3和Rad21構(gòu)成，磷酸化后激活，DSB形成時(shí)聚集并增進(jìn)修復(fù)。敲除53BP1、H2AX和MDC基因后，SMC1、SMC3的磷酸化減少；敲除Rad21引發(fā)細(xì)胞周期分布變化，G1期細(xì)胞較S期、G2期、M期多[24]?？傊?，DSB是細(xì)胞受到電離輻射后發(fā)生的最嚴(yán)重DNA損傷，其修復(fù)機(jī)制復(fù)雜且與腫瘤發(fā)病和治療親密有關(guān)。近年來有關(guān)其修復(fù)機(jī)制研究始終是腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，其中HR修復(fù)作為保護(hù)基因組完整性的重要機(jī)制受到越來越多的關(guān)注，重要集中于3個(gè)方面：（1）HR修復(fù)基因缺點(diǎn)與多個(gè)腫瘤發(fā)病有關(guān)，如何篩查攜帶這些突變基因的高危人群達(dá)成防止腫瘤的目的是腫瘤防止的難點(diǎn)，如何檢測(cè)腫瘤患者中這些突變基因以期制訂合理的治療方略；（2）通過克制腫瘤細(xì)胞HR修復(fù)通路特別是合成致死，增加腫瘤放化療敏感性，為腫瘤的靶向治療提出了一種新的思路；（3）DNA損傷修復(fù)涉及多個(gè)修復(fù)機(jī)制，進(jìn)一步研究它們之間的聯(lián)系，增進(jìn)其在腫瘤治療的應(yīng)用研究。進(jìn)一步理解DSB與HR修復(fù)之間的分子機(jī)制并將其應(yīng)用于腫瘤個(gè)體化治療有望突破腫瘤治療成功的瓶頸。參考文獻(xiàn)[1]KrejciL，AltmannovaV，SpirekM，etal.Homologousrecombinationanditsregulation[J].NucleicAcidsRes，，40（13）：5795-5818.[2]CerbinskaiteA，MukhopadhyayA，PlummerER，etal.Defectivehomologousrecombinationinhumancancers[J].CancerTreatRev，，38（2）：89-100.[3]RenkawitzJ，LademannCA，JentschS.Mechanismsandprinciplesofhomologysearchduringrecombination[J].NatRevMolCellBiol，，15（6）：369-383.[4]MakharashviliN，TubbsAT，YangSH，etal.catalyticandnoncatalyticrolesoftheCtIPendonucleaseindouble-strandbreakendresection[J].MolCell，，23（2）：59-60.[5]LordCJ，AshworthA.MechanismsofresistancetotherapiestargetingBRCA-mutantcancers[J].NatMed，，19（11）：1381-1388.[6]ShakyaR，ReidLJ，ReczekCR，etal.BRCA1tumorsuppressiondependsonBRCTphosphoproteinbinding，butnotitsE3ligaseactivity[J].Science，，334（6055）：525-528.[7]MedovaM，AebersoldDM，ZimmerY.METinhibitionintumorcellsbyPHA665752impairshomologousrecombinationrepairofDNAdoublestrandbreaks[J].IntJCancer，，130（3）：728-734.[8]MalumbresM，BarbacidM.Cellcycle，CDKsandcancer：achangingparadigm[J].NatRevCancer，，9（3）：153-166.[9]GuoGS，ZhangFM，GaoRJ，etal.DNArepairandsyntheticlethality[J].IntJOralSci，，3（4）：176-179.[10]BuntingSF，NussenzweigA.End-joining，translocationsandcancer[J].NatRevCancer，，13（7）：443-454.[11]MunozMC，YanezDA，StarkJM.AnRNF168fragmentdefectiveforfocalaccumulationatDNAdamageisproficientforinhibitionofhomologousrecombinationinBRCA1deficientcells[J].NucleicAcidsRes，，25（16）：23-24.[12]BergsJW，KrawczykPM，BorovskiT，etal.Inhibitionofhomologousrecombinationbyhyperthermiashuntsearlydoublestrandbreakrepairtonon-homologousend-joining[J].DNARepair（Amst），，12（1）：38-45.[13]DeverSM，WhiteER，HartmanMC，etal.BRCA1-directed，enhancedandaberranthomologousrecombination：mechanismandpotentialtreatmentstrategies[J].CellCycle，，11（4）：687-694.[14]TowlerWI，ZhangJ，RansburghDJ，etal.AnalysisofBRCA1variantsindouble-strandbreakrepairbyhomologousrecombinationandsingle-strandannealing[J].HumMutat，，34（3）：439-445.[15]MaxwellKN，DomchekSM.CancertreatmentaccordingtoBRCA1andBRCA2mutations[J].NatRevClinOncol，，9（9）：520-528.[16]EversB，HelledayT，JonkersJ.Targetinghomologousrecombinationrepairdefectsincancer[J].TrendsPharmacolSci，，31（8）：372-380.[17]LinWY，CampNJ，Cannon-AlbrightLA，etal.AroleforXRCC2genepolymorphismsinbreastcancerriskandsurvival[J].JMedGenet，，48（7）：477-484.[18]NogueiraA，CatarinoR，CoelhoA，etal.InfluenceofDNArepairRAD51genevariantsinoverallsurvivalofnon-smallcelllungcancerpatientstreatedwithfirstlinechemotherapy[J].CancerChemotherPharmacol，，66（3）：501-506.[19]ChoiYE，BattelliC，WatsonJ，etal.Sublethalconcentrationsof17-AAGsuppresshomologousrecombinationDNArepairandenhancesensitivitytocarboplatinandolaparibinHRproficientovariancancercells[J].Oncotarget，，5（9）：267