半制備型高效液相色譜分離生姜中6-姜酚

半制備型高效液相色譜分離生姜中6-姜酚

作為生姜中最重要的藥物活性成分，6-生姜酚具有多種藥物活性物質(zhì)：健胃與抗?jié)?、肝臟保護(hù)、膽囊強(qiáng)化、消炎、中樞神經(jīng)抑制作用、抗炎、腫瘤等。因此研究6-姜酚的分離提純,無(wú)論對(duì)于進(jìn)一步研究6-姜酚的性質(zhì),還是將其應(yīng)用于臨床都有著重要的意義。隨著人們對(duì)天然藥物的認(rèn)同感和重視程度的日益提高,研制開(kāi)發(fā)從植物中提取單體已成為一個(gè)具有廣闊應(yīng)用前景的發(fā)展方向。但是同其他植物藥如紫杉醇已形成工業(yè)化生產(chǎn)并已應(yīng)用于臨床相比,6-姜酚的研制開(kāi)發(fā)要相對(duì)滯后得多。從文獻(xiàn)查閱情況來(lái)看,目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有6-姜酚單體制備的報(bào)道。黃雪松用硅膠薄板層析結(jié)合葡聚糖凝膠層析法進(jìn)行分離純化,獲得了姜酚的同系物。但是從探索一條能夠制備高純單體且能工業(yè)化生產(chǎn)的角度來(lái)考慮,此法尚存在兩個(gè)難以解決的問(wèn)題。一方面,薄板層析樣品處理量小;另一方面,此法獲得的不是單體,而是一組同系物。本文提出的6-姜酚分離提純法,較好地解決了這兩方面的問(wèn)題,為將來(lái)較大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行了有益的嘗試。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器和分析方法高效液相色譜Hi-Tech7000LC;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)Lambd-a7型;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀TraceGC-MS2000型;FT-IR紅外吸收光譜儀EQUINOX55型;Millipore溶劑過(guò)濾系統(tǒng)。6-姜酚純品;粗姜酚(自制);BKSOL1、BKSOL2為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。1.2流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)液相色譜柱:C18,20.0mm×300mm,15μm;流速:11.0mL·min-1;流動(dòng)相:BKSOL1-水-BKSOL2(60+39+1);檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;進(jìn)樣量:0.5mL。1.3分離條件篩選以粗姜酚為樣品,通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的不同配比及流速,進(jìn)行分離條件篩選,然后固定分離條件,改變進(jìn)樣體積,考查進(jìn)樣體積對(duì)分離的影響,最后在所選最優(yōu)條件下,對(duì)6-姜酚進(jìn)行分離。2結(jié)果與討論2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取適量6-姜酚純品,用色譜流動(dòng)相溶解,測(cè)定6-姜酚在190~400nm區(qū)間的吸收光譜,發(fā)現(xiàn)它在230nm和280nm處有較大吸收,因?yàn)樵?30nm處檢測(cè)器穩(wěn)定性較差,且溶劑吸收峰干擾較大,所以本文選用280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。2.2流動(dòng)相及bskol2的選擇考慮到提純出的6-姜酚是藥用品,因此必需考慮殘留試劑毒性的大小。另外,由于本文是在為將來(lái)較大規(guī)模生產(chǎn)摸索條件,生產(chǎn)的成本高低也是我們選擇流動(dòng)相的一個(gè)重要依據(jù),所以,兼顧到生產(chǎn)成本和殘留毒性,我們選擇BKSOL1作流動(dòng)相,同時(shí)加入BKSOL2以改善分離效果。2.3分離度的測(cè)定考察了BKSOL1體積比在35%~70%范圍內(nèi)變化對(duì)6-姜酚分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在其它條件保持恒定的情況下,BKSOL1的體積比越大,6-姜酚出峰越快,分離周期越短,但是隨之而來(lái)的是,分離度越低。BKSOL1體積比在35%~60%間變化時(shí),對(duì)保留時(shí)間影響顯著,當(dāng)BKSOL1體積比增加至60%后,BKSOL1體積比的變化對(duì)保留時(shí)間的影響趨于平緩,考慮到保留時(shí)間,兼顧到分離度,最終選用的BKSOL1體積比為60%。2.4流動(dòng)相bki比對(duì)分離的影響考慮到6-姜酚的弱酸性以及酚類(lèi)物質(zhì)的易氧化性,我們?cè)诹鲃?dòng)相中添加少量的BKSOL2。結(jié)果表明:BKSOL2的加入不僅可以提高分離度和防止峰的拖尾,明顯改善峰形,縮短分離周期,還可以提供酸性體系,防止6-姜酚在中性或堿性條件下的氧化,起到延緩6-姜酚氧化的作用。在流動(dòng)相中分別加入0.0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%體積比的BKSOL2,結(jié)果表明:BKSOL2體積比在1.0%之前,對(duì)分離影響較大,隨著B(niǎo)KSOL2體積比的增加,6-姜酚的保留時(shí)間縮短,分離選擇性得到提高。BKSOL2體積比為1.0%或1.5%,對(duì)分離影響不大,從譜圖上看不出明顯差異?？紤]到酸度大對(duì)柱壽命的影響,選擇BKSOL2的添加比例為1.0%。2.5-姜酚的hplc測(cè)定8.0、9.0,10.0和11.0mL·min-1,保持其它條件不變,進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著流速的增大,6-姜酚保留時(shí)間提前,分離度變小。當(dāng)流速增加至9.0mL·min-1后,流速對(duì)分離周期的影響趨于平緩。從分離周期的角度考慮,兼顧到分離度,流速選擇為:10.0mL·min-1。2.6對(duì)分離的影響在流動(dòng)相組成為60%BKSOL1,流速10.0mL·min-1下,考查進(jìn)樣量分別為14.24、21.36、28.48、35.60、42.72mg時(shí)對(duì)分離的影響。結(jié)果表明,進(jìn)樣量在14.24~42.72mg范圍內(nèi)變化,對(duì)保留時(shí)間沒(méi)有影響,但隨著進(jìn)樣量的增加,譜峰逐漸變寬,分辨率逐漸降低,分離度減小,尤其是當(dāng)進(jìn)樣量增至42.72mg后,譜峰展寬和拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重,色譜分辨率和分離效果急劇下降,說(shuō)明進(jìn)樣量已超出等溫吸附的線(xiàn)性范圍,因此進(jìn)樣量選擇為30mg。2.76-姜酚的分離在上述所選分離條件下,對(duì)6-姜酚進(jìn)行分離,色譜圖如圖1所示。從圖1看出,此條件完全滿(mǎn)足色譜分離制備要求,可基本實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離。2.8