蝎皮中的水溶蛋白和角蛋白分離及體外藥理篩選

蝎皮中的水溶蛋白和角蛋白分離及體外藥理篩選

蝎子是一種常見的中藥，被列入《中國藥典》（2000年版）。藥用全蝎為節(jié)肢動物門蛛型綱蝎目鉗蝎科東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch,在我國分布廣泛。現(xiàn)已經(jīng)證明,全蝎具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛等功效,蝎毒是全蝎的主要活性成分之一,其成分復(fù)雜,含有多種多肽(分子質(zhì)量范圍3～9kD)和蛋白質(zhì)。蝎皮scorpiitegument(ST)是蝎子生長過程中的代謝產(chǎn)物,由于來源稀少,一直沒有進行研究。本研究從東亞鉗蝎生長過程中的代謝產(chǎn)物蝎皮中分離分子質(zhì)量大于8kD以上的水溶性蛋白和角蛋白成分進行體外藥物活性篩選研究,發(fā)現(xiàn)其對T/B淋巴細胞轉(zhuǎn)化具有顯著促進作用,為開發(fā)全蝎活性代謝產(chǎn)物-蝎皮中的活性蛋白質(zhì)成分研究提供了實驗依據(jù)。1材料表面1.1s-東南角蛋白及多糖2～6年生蝎皮由江蘇海門市家養(yǎng)蝎子技術(shù)咨詢服務(wù)站蔡政提供。SDS低分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)為中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品。伴刀豆球蛋白A(ConA)為Sigma公司產(chǎn)品。脂多糖(LPS)購自華美生物有限公司。其余試劑均為分析純或生化試劑。1.2材料、實驗方法和儀器上海安亭科學(xué)儀器廠GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機,中國科學(xué)院生物物理所科龍儀器廠XZ-7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,美國VISKASE透析袋MD34,規(guī)格MW8-10kDa,34MM,日本TokyoRikakikaiCo.LtdEYE-LAFREEZEDRYERFD-1冷凍干燥機,天津血液研究所葡聚糖凝膠SephadexG-50填料,北京市六一儀器廠DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYCZ-24D型垂直板電泳槽,德國BMG公司產(chǎn)Flustar微板多功能測定儀。1.3動物保護gBALB/c小鼠,雌性,體重18～22g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所繁育場。Yac-1細胞(小鼠NK敏感細胞株),購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。2實驗方法2.1蛋白質(zhì)純化將400g蝎皮經(jīng)粉碎機粉碎,加入5000mL蒸餾水,磁力攪拌器溫和攪拌(18℃),約4h溶液呈過飽和狀,將溶液靜置分層,取出上層淡黃色提取液,經(jīng)在4～10℃條件下8000r·min-1離心10min取上清液進行抽濾,得淡黃色透明液體。加水抽提重復(fù)實驗直到硫酸銨鹽析實驗呈陰性為止。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將總蛋白質(zhì)溶液濃縮適量。按比例在總蛋白溶液中加入硫酸銨鹽析進行蛋白質(zhì)純化實驗,其飽和濃度應(yīng)達到90%。4℃條件下48h靜置后,得到淡黃色絮狀沉淀。4～10℃條件下6000r·min-1離心10min收集蛋白沉淀物,用一定比例的蒸餾水溶解蛋白沉淀物,在18℃條件下溫和攪拌3h促溶,待蛋白質(zhì)溶解完全后離心,收集上蛋白清液。將剩余沉淀物加入蒸餾水繼續(xù)溶解,攪拌促溶、離心,收集上層蛋白溶液,棄去雜質(zhì)沉淀。合并上清蛋白溶液,4℃下透析除鹽,3d后經(jīng)鋇鹽檢驗證實透析完全。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30℃條件下充分濃縮透析后的蛋白溶液,經(jīng)冷凍干燥后最終獲得1.395g蝎皮水溶性總蛋白質(zhì)粉末。2.2蛋白液的制備本實驗使用蝎皮水溶性蛋白質(zhì)提取后的殘渣進行了角蛋白的提取。將蝎皮水溶性蛋白粗提物殘渣經(jīng)30℃烘干后得到淡黃色粉末,分別加入65mL巰基乙酸(14mol·L-1)、1920g尿素(8mol·L-1)和蒸餾水至4000mL。用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至10,18℃條件下攪拌48h。倒出上清液,4～10℃條件下8000r·min-1離心8min并抽濾,濾液用醋酸調(diào)節(jié)pH至中性后透析去除尿素,每天換水3次,3d后透析完全,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀充分濃縮蛋白溶液。冷凍干燥,最終獲得1.463g總角蛋白粉末。2.3色譜柱及色譜條件分別取蝎皮水溶性總蛋白質(zhì)和總角蛋白各1g,用蒸餾水溶解并分多次加樣到SephadexG-50(2.6cm×100cm)凝膠色譜柱上,蛋白質(zhì)為10g·L-1。用蒸餾水洗脫,流速1.0mL·min-1。洗脫組分用紫外檢測儀280nm處檢測,按檢測峰不同部分收集各流出組分,所得組分經(jīng)冷凍干燥后,最終獲得蝎皮各不同蛋白質(zhì)組分。2.4量蛋白及氨基酸電泳方法采用不連續(xù)膠系統(tǒng),5%濃縮膠和12%分離膠,考馬斯亮藍法染色,標準分子量蛋白為兔磷酸化酶B(97.4kD),牛血清白蛋白(66.2kD),兔肌動蛋白(43kD),牛碳酸酐酶(31kD),胰蛋白酶抑制劑(20.1kD),雞蛋清溶菌酶(14.4kD)。以檢測蝎皮各蛋白質(zhì)組分蛋白質(zhì)分子量的分布情況。2.5細胞轉(zhuǎn)化率測定常規(guī)無菌取BALB/c小鼠的脾臟經(jīng)研磨棒輕輕研磨后,過200目鋼網(wǎng),用1640培養(yǎng)液洗1次,2000r·min-1離心5min,細胞沉淀用雙蒸水、雙鹽水各洗1min破壞紅細胞,離心棄上清。用1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至2×106·mL-1,100μL/孔,種于96孔板,同時加ConA(終含量5mg·L-1)或LPS(終含量5mg·L-1),90μL/孔。加樣品10μL/孔,另設(shè)陰性對照孔(加誘導(dǎo)劑,未加藥)、空白對照孔(未加誘導(dǎo)劑,未加藥)37℃,5%CO2孵育72h,培養(yǎng)結(jié)束前4h,加刃天青10μL(終含量5μmol·L-1),培養(yǎng)結(jié)束后,測定熒光強度(激發(fā)波長530nm,發(fā)射波長590nm),并按下列公式計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率(%)=(樣品孔熒光值-陰性對照孔熒光值)/(陰性對照孔熒光值-空白對照孔熒光值)×100%2.6實驗細胞和細胞系統(tǒng)取小鼠脾細胞同上,1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞含量至5×109·L-1,另取YAC-1,1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至5×108·L-1,分別種于96孔板。設(shè)以下組別:效應(yīng)細胞組(脾細胞,100μL/孔)、靶細胞組(Yac-1細胞,100μL/孔),效應(yīng)細胞和靶細胞實驗組(脾細胞和Yac-1細胞,各100μL/孔)。37℃,5%CO2孵育24h后,培養(yǎng)結(jié)束前4h加MTT(終含量500mg·L-1),培養(yǎng)結(jié)束后測A值。按以下公式計算殺傷率(%):NK殺傷率=(A效應(yīng)細胞+A靶細胞-A實驗組)/A靶細胞×100%3結(jié)果3.1紫外吸收法檢測總蛋白質(zhì)的表達分別取1g水溶性總蛋白和總角蛋白上樣,用SephadexG-50(2.6cm×100cm)凝膠色譜柱,蒸餾水洗脫,水溶性總蛋白質(zhì)獲得2個(ST1-01,ST1-02)無紫外吸收部分和2個(ST1-1,ST1-2)紫外吸收峰部分(圖1),每個紫外吸收峰按上下兩部分分段收集,最終將水溶性總蛋白質(zhì)分成6個組分?？偨堑鞍踪|(zhì)獲得1個(ST2-01)無紫外吸收部分和3個(ST2-1,ST2-2,ST2-3)紫外吸收峰部分(圖2),每個紫外吸收峰按上下兩部分分段收集,最終將總角蛋白質(zhì)分成7個組分。其每種總蛋白質(zhì)的回收率分別為51.3%和59.5%。在雙縮脲反應(yīng)中,13個蛋白質(zhì)組分的堿性溶液與銅離子相互作用,產(chǎn)生紫色的絡(luò)合物,證明分離獲得的各組分中均含有蛋白質(zhì)成分。3.2sds-東南角電泳將凝膠色譜所得蛋白質(zhì)組分進行SDS檢測,其中3個樣品(ST1-01,ST2-01,ST2-3S)組分含量太少,故未無法進行SDS電泳實驗。其他10個組分包括5個水溶性蛋白質(zhì)組分:ST1-1S,ST1-1X,ST1-02,ST1-2S和ST1-2X和5個角蛋白質(zhì)組分:ST2-1S,ST2-1X,ST2-2S,ST2-2X和ST2-3X,其SDS電泳實驗結(jié)果分別見圖3、圖4所示。3.3t/b細胞基因突變試驗選擇經(jīng)SDS電泳實驗的10個蛋白質(zhì)組分樣品進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗和NK活性殺傷實驗,篩選實驗結(jié)果見圖5,圖中給出各蛋白組分對于T/B淋巴細胞轉(zhuǎn)化情況,結(jié)果顯示它們均對T/B淋巴細胞轉(zhuǎn)化存在顯著的促進作用,特別是組分ST1-2X和ST2-1S的T細胞淋轉(zhuǎn)率高達190.27%和183.69%,但各組分對NK細胞殺傷活性則無明顯改善。4蛋白質(zhì)成分基因組織的初步篩選4.1人類對東亞鉗蝎的研究主要集中在全蝎與蝎毒,全蝎和蝎毒一直被認為是其藥物活性所在,其研究結(jié)果較多,但未見對于蝎子的代謝產(chǎn)物蝎皮成分研究的報道。蝎子一生中大約需要褪皮六七次,這些物質(zhì)一直沒有得到有效利用。4.2實驗選擇2～6年生東亞鉗蝎蝎皮作為研究對象,使用400g樣品中經(jīng)過水提和還原分別實驗獲得分子量在8kD以上的水溶性總蛋白質(zhì)1.395g和總角蛋白質(zhì)1.463g,2種總蛋白質(zhì)的收率分別為0.35%和0.36%。蝎皮樣品中蛋白質(zhì)成分收率較低說明在蝎皮殼中蛋白質(zhì)主要是其結(jié)締及保護性的功能蛋白質(zhì),因而水溶性蛋白質(zhì)和角蛋白質(zhì)含量較低。4.4通過SDS電泳實驗證實水溶性蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要成分集中在40kD以下;而角蛋白中的蛋白質(zhì)成分的分子量則比較分散,其中ST2-2X,ST2-3X組分含有的蛋白主要成分在30kD以上。4.5在角蛋白質(zhì)組分的SDS電泳實驗中發(fā)現(xiàn)ST2-1S,ST2-1X和ST2-2S條帶具有連續(xù)分布性質(zhì),故懷疑這些組分中含有色素成分,影響了蛋白質(zhì)成分的顯色。4.6通過雙縮脲實驗反應(yīng)證實分離獲得蝎皮的13個蛋白質(zhì)組分中均含有蛋白質(zhì)成分。4.7體外藥理篩選實驗結(jié)果表明,蝎皮中的水溶性蛋白質(zhì)組分和角蛋白質(zhì)組分均對于T/B淋巴細胞轉(zhuǎn)化顯示顯著的促進作用,特別是其中的ST1-2X和ST2-1S組分對T細胞淋轉(zhuǎn)率高達190.27%和183.69%。4.8本項目研究選擇蝎皮中分子質(zhì)量8000以上的蛋白質(zhì)組分作為研究對象,分別對水溶性蛋白質(zhì)與角蛋白質(zhì)