烏梅白鳳丸對動脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響

烏梅白鳳丸對動脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響

女性進入更年期后，由于卵巢機制的衰退和雌激素水平的降低，導致脂肪和膽固醇的異常代謝，以及動脈樣本硬化（as）的形成。我們早期的研究發(fā)現(xiàn)烏雞白鳳丸對脂代謝紊亂有明顯的調(diào)整作用,為進一步研究烏雞白鳳丸防治動脈粥樣硬化的血管損傷的機制,本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)法建立大鼠早期動脈粥樣硬化模型,探討烏雞白鳳丸有效成分對血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。1材料和方法1.1乙醇超聲提取法烏雞白鳳丸(9g/丸),藥都制藥集團股份有限公司提供,用80%乙醇超聲提取器中提取兩次,每次兩小時,減壓濃縮至2g生藥/ml備用;吉非羅齊,保定市古城藥廠,批號040625,實驗前用CMC配制濃度為0.016g/ml溶液備用。1.2實驗動物及飼料SD大鼠清潔級,體重180～200g,雄性,由河北省實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(冀)2003-1-003,動物飼料亦由該中心提供。1.3試劑TC、TG、LDL、HDL試劑盒,日本協(xié)和株式會社提供;Caspase-3兔抗人多克隆抗體,由美國SantaCruz公司提供。1.4儀器全自動生化分析儀(瑞士);Epics-XLⅡ型流式細胞儀,美國BeckmanCoulter公司。1.5血管內(nèi)皮凋亡及caspase-3活性的檢測大鼠隨機分為5組,除正常對照組外,其余各組采用高脂飼料(2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、0.02%他巴唑、普通飼料87.48%)喂養(yǎng),同時灌胃烏雞白鳳丸或吉非羅齊混懸液,模型對照組和正常對照組給予等容量的自來水,連續(xù)10周。給藥10周后,各組大鼠禁食12小時,乙醚麻醉,眶后靜脈取血,分離血清,全自動生化分析儀測定TC、TG、LDL、HDL水平;各組隨機取6只大鼠,剖取胸主動脈約2cm長,剝?nèi)?nèi)膜,70%乙醇固定,制備單細胞懸液,碘化丙啶染色,同時設陰性對照,以替代一抗,陽性對照只加一抗或只加二抗,流式細胞儀檢測血管內(nèi)皮細胞的凋亡及Caspase-3的蛋白表達,數(shù)據(jù)采集為對數(shù)(log)方式,應用Expo32ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。計數(shù)10000個細胞,計算凋亡率(AP)。AP=凋亡細胞數(shù)細胞總數(shù)×100%AΡ=凋亡細胞數(shù)細胞總數(shù)×100%用MuticycleAV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析,計算出DNA組方圖各時相分布的百分比,以增殖指數(shù)(PI)表示細胞的增殖活性:PI=S+G2/MG0/G1+S+G2/M×100%ΡΙ=S+G2/ΜG0/G1+S+G2/Μ×100%2結(jié)果2.1大鼠脂代謝應從結(jié)果可見,模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL、HDL均較正常對照組大鼠升高,表明大鼠連續(xù)10周喂養(yǎng)高脂飼料,已造成大鼠脂代謝紊亂。烏雞白鳳丸及陽性對照藥組大鼠血清TC、TG、LDL均較模型組顯著降低,見表1。2.2率、caspase-3的表達情況Caspase-3蛋白表達的影響結(jié)果模型對照組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表達量顯著高于正常對照組,增殖指數(shù)明顯低于正常對照組;烏雞白鳳丸大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的凋亡率及Caspase-3蛋白表達量較模型對照組大鼠降低,而增殖指數(shù)較模型對照組大鼠增高,見表2。3細胞凋亡的形成AS的發(fā)病有明顯的性別差異,育齡期婦女發(fā)生率明顯低于男性,但婦女絕經(jīng)后這一差異逐漸消失,由此推測絕經(jīng)前婦女體內(nèi)具有某種保護因素,使其免受AS的侵襲?，F(xiàn)今,這種保護因素被認為是雌激素。中西醫(yī)結(jié)合對腎本質(zhì)的研究表明,腎虛時有下丘腦-垂體-性腺軸的功能減退,雌激素分泌減少。烏雞白鳳丸具有滋補肝腎,調(diào)補氣血之功,尤重填補腎精,為烏雞白鳳丸防治婦女絕經(jīng)后AS提供了中醫(yī)理論依據(jù)。近幾年發(fā)現(xiàn)細胞異常凋亡在多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中起重要的作用,特別是在高脂血癥斑塊中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞都經(jīng)歷著凋亡與壞死,而凋亡占主導地位,參與AS的形成過程。細胞凋亡在AS斑塊中明顯加劇,出現(xiàn)大量細胞凋亡與細胞增殖,組成AS斑塊的病理基礎。大量研究也證實了人類AS斑塊中存在細胞凋亡。由于凋亡細胞在體內(nèi)存在時間極短,低比例的凋亡發(fā)生即意味著大量的細胞凋亡已經(jīng)發(fā)生。Caspase-3屬于半胱氨酸蛋白酶,相當于線蟲中的ced-3,在破壞細胞骨架結(jié)果方面有重要作用,這些蛋白酶是引起細胞凋亡的關鍵酶,一旦被信號途徑激活,能將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解,使細胞不可逆的走向死亡。因此,若能控制該酶的活性對凋亡的結(jié)局可產(chǎn)生重要影響。本實驗采用高脂食飼法造成大鼠早期動脈粥樣硬化模型,我們在實驗中發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠較正常對照組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞凋亡率明顯升高,增殖指數(shù)明顯降低,Caspase-3的蛋白表達也明顯升高;應用烏雞白鳳丸后,主動脈內(nèi)皮細胞Caspase-3的蛋白表