大腸埃希菌脂多糖對(duì)雞脂肪代謝及相關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

大腸埃希菌脂多糖對(duì)雞脂肪代謝及相關(guān)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

細(xì)菌感染是水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要危害，嚴(yán)重影響了動(dòng)物的健康生長(zhǎng)，降低了身體的生產(chǎn)效率。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)為革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分,是細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotoxin)的主要物質(zhì)。細(xì)菌感染動(dòng)物后釋放出的LPS首先與血漿中的LPS結(jié)合蛋白形成復(fù)合物,進(jìn)一步與細(xì)胞膜上的受體蛋白結(jié)合,從而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞,合成并釋放出腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactorα,TNFα)、白介素1(Interleukin1,IL1)、白介素6(Interleukin6,IL6)等多種炎癥因子,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、代謝紊亂、循環(huán)障礙等炎癥癥狀。研究發(fā)現(xiàn),這些炎癥反應(yīng)主要是由于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答所造成的。目前,關(guān)于LPS對(duì)哺乳動(dòng)物影響的研究較多,而在禽類(lèi)方面的相關(guān)研究較少,過(guò)去普遍認(rèn)為禽類(lèi)對(duì)于細(xì)菌內(nèi)毒素的抵御能力比哺乳動(dòng)物更強(qiáng),但是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),LPS同樣能夠影響禽類(lèi)的生理和代謝變化,表現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物相似但又不完全相同的反應(yīng)。動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)的合成與分解(脂肪代謝)是機(jī)體能量處于穩(wěn)態(tài)的重要保障,脂肪代謝受到多種酶、激素和蛋白因子的調(diào)控。脂肪代謝的紊亂會(huì)影響動(dòng)物的健康生長(zhǎng),造成動(dòng)物肥胖癥、胰島素抵抗、高血脂等代謝病癥。LPS感染機(jī)體后可激活效應(yīng)細(xì)胞釋放出大量細(xì)胞因子,從而對(duì)脂肪代謝的調(diào)控因子產(chǎn)生不同的影響,進(jìn)而改變了動(dòng)物的脂肪代謝平衡。目前,關(guān)于LPS對(duì)禽類(lèi)脂肪代謝影響的相關(guān)報(bào)道很少。為此,本試驗(yàn)以烏雞為試驗(yàn)動(dòng)物,給其持續(xù)注射大腸埃希菌LPS后,檢測(cè)脂肪代謝相關(guān)酶的活性和調(diào)控基因表達(dá)的水平,研究了大腸埃希菌LPS感染后烏雞體內(nèi)脂肪代謝的變化,以期為雞大腸桿菌相關(guān)的病理學(xué)研究提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物烏雞(公雞)購(gòu)自陜西省三原縣畜牧站,共120只。1.1.2試劑與試劑盒大腸埃希菌LPS,Sigma公司產(chǎn)品。甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒,均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。游離脂肪酸(FFA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。脂蛋白脂酶、肝脂酶和脂肪酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RNAisoPlus試劑盒、SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒和PrimescriptRTreagentkit試劑盒,TaKaRa公司產(chǎn)品。iQ5型實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng),Biorad公司產(chǎn)品。1.2兩組雞的lps用量和用量對(duì)比在烏雞35日齡時(shí)將其隨機(jī)分為對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組(低劑量LPS組、中劑量LPS組、高劑量LPS組),每組30只。試驗(yàn)組雞只每48h注射1次不同濃度的大腸埃希菌LPS生理鹽水溶液,劑量為1mL/(只·次),低、中、高劑量LPS組雞只的LPS用量分別為0.25,0.5和1mg/(kg·次);對(duì)照組注射等量生理鹽水。每次注射后12h,測(cè)量各組雞只泄殖腔的溫度。試驗(yàn)持續(xù)2周。因注射LPS后雞在短時(shí)間內(nèi)不進(jìn)食,為保證試驗(yàn)準(zhǔn)確,每次注射后4h內(nèi)對(duì)照組也采取禁食措施。日糧參照雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T33-2004)設(shè)置。1.3血脂和酶活性49日齡時(shí),每組隨機(jī)抽取10只雞,注射肝素10U/kg,10min后翅下靜脈采血,分離血清用于血脂和酶活性的檢測(cè)。雞采血后立即屠宰,分別取腿肌和腹部脂肪組織約0.5g,迅速保存于液氮中,用于RNA的提取。1.4影響烏江生產(chǎn)性能和體脂沉積的因素1.4.1生產(chǎn)力試驗(yàn)分別在雞只35,42和49日齡時(shí)稱體質(zhì)量,并計(jì)算全期日增質(zhì)量和料質(zhì)量比。1.4.2皮下脂肪層厚度檢測(cè)取采血后屠宰雞的胸部肌肉塊和大腿肌肉塊,采用索氏抽提法測(cè)定肌肉中的粗脂肪含量,計(jì)算胸肌脂肪率、腿肌脂肪率;剝離腹部脂肪塊并稱質(zhì)量,計(jì)算腹脂率;用游標(biāo)卡尺測(cè)量背正中線皮下脂肪層厚度。胸肌脂肪率=(胸肌粗脂肪含量/胸肌質(zhì)量)×100%;腿肌脂肪率=(腿肌粗脂肪含量/腿肌質(zhì)量)×100%;腹脂率=(腹部脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。1.5l-c、tc和ffa的表達(dá)按照試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)各組雞血清中TG、HDL-C、LDL-C、TC和FFA的濃度,以及脂蛋白脂酶(Lipoproteinlipase)、肝脂酶(Hepaticlipase)、脂肪酶(Lipase)的活性。1.650年代的流行性感染對(duì)山羊脂代謝的影響1.6.1基于生物酶活性的目標(biāo)化合物使用TaKaRa公司的RNAisoPlus試劑盒分別提取雞只腹部脂肪和腿肌中的總RNA,用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。以合格的RNA為模板,采用TaKaRa公司的PrimescriptRTreagentkit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,反應(yīng)體系為:2μL5×primescriptbuffer,0.5μLPrimescriptRTEnzymeMix1,0.5μLRandom6mers,0.5μLOligodtPrimer,1μLTotalRNA,5.5μLRnaseFreeddH2O;反應(yīng)條件為:37℃15min,85℃5s。1.6.2定量pcr檢測(cè)根據(jù)GeneBank已公布的雞目標(biāo)基因的參考序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1),引物由南京金斯瑞生物技術(shù)公司合成。使用TaKaRa公司SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑盒,對(duì)脂肪代謝調(diào)控基因FAS、ACC、LPL、PPARα、CPT-1及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控基因FATP1、FATP4、FAT/CD36和FABP進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系:SYBRPremixExTaqTMⅡ(2×)12.5μL,Forwardprimer1μL,Reverseprimer1μL,DNA模板2μL,ddH2O8.5μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃5s,60℃35s,40個(gè)循環(huán)。利用Biorad公司iQ5型實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。定量PCR結(jié)果以參照基因β-actin為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量分析,采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。△△CT=試驗(yàn)組CT(目標(biāo)基因表達(dá)量-β-actin表達(dá)量)-對(duì)照組CT(目標(biāo)基因表達(dá)量-β-actin表達(dá)量)。1.7數(shù)據(jù)處理和檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和T檢驗(yàn)。采用Duncan法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。2結(jié)果與分析2.1急性反應(yīng)期觀察發(fā)現(xiàn),LPS處理可引起烏雞明顯的生理反應(yīng),如困倦、嗜睡、腹瀉、停止進(jìn)食和飲水,特別是短時(shí)間內(nèi)機(jī)體發(fā)熱,而這些癥狀一般會(huì)持續(xù)24h左右,且在6～12h是急性反應(yīng)期。圖1顯示,每次LPS注射后12h,3個(gè)試驗(yàn)組烏雞的泄殖腔溫度均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),而不同劑量LPS處理之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。2.2兩組平均體質(zhì)量和日增質(zhì)量表2顯示,試驗(yàn)開(kāi)始時(shí),各組烏雞平均體質(zhì)量無(wú)明顯差異,而到42日齡時(shí),對(duì)照組烏雞的平均體質(zhì)量極顯著高于各試驗(yàn)組(P<0.01),且試驗(yàn)組雞的體質(zhì)量隨著LPS劑量的增加而極顯著減少(P<0.01);49日齡時(shí),對(duì)照組烏雞的平均體質(zhì)量依然極顯著高于各試驗(yàn)組(P<0.01),低劑量LPS組體質(zhì)量極顯著高于中、高劑量LPS組(P<0.01),中、高劑量LPS組體質(zhì)量差異不明顯(P>0.05)。對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組烏雞的日增質(zhì)量極顯著高于LPS處理組(P<0.01),且處理組雞的日增質(zhì)量隨著LPS劑量的增大而減小(P<0.01)。各試驗(yàn)組烏雞的料質(zhì)量比均極顯著高于對(duì)照組,且隨著LPS劑量的增大而增大(P<0.01)。2.3低劑量lps對(duì)雞由表3可見(jiàn),LPS感染造成了烏雞體內(nèi)脂肪沉積的顯著下降(49日齡)。對(duì)照組烏雞的胸肌脂肪率、腿肌脂肪率、腹脂率和皮下脂肪厚度都極顯著高于3個(gè)試驗(yàn)組(P<0.01)。試驗(yàn)組中,低劑量LPS組烏雞的胸肌脂肪率、腹脂率、皮下脂肪厚度均最大,其次為中劑量LPS組,高劑量LPS組最低。中劑量LPS組與低劑量LPS組烏雞的腿肌脂肪率無(wú)顯著差異,但均極顯著高于高劑量LPS組。2.4對(duì)雞血清tg、ffa的影響表4顯示,對(duì)照組烏雞血清中的TC、LDL-C和HDL-C濃度均極顯著高于各試驗(yàn)組(P<0.01),且各試驗(yàn)組TC、LDL-C和HDL-C濃度均隨著LPS劑量的增大而減少。與此不同,試驗(yàn)組烏雞血清中的TG和FFA濃度則極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。各試驗(yàn)組烏雞血清中脂蛋白脂酶、肝脂酶和脂肪酶的活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),脂肪酶的活性隨著LPS劑量增大而升高,而脂蛋白脂酶和肝脂酶活性均以中劑量LPS組最大。2.5不同lps劑量對(duì)雞脂肪和肌肉中pparmrna表達(dá)的影響LPS感染對(duì)烏雞脂肪和肌肉中脂肪代謝調(diào)控基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出,LPS感染對(duì)烏雞體內(nèi)脂肪代謝調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生明顯的影響。從圖2還可以看出,與對(duì)照組相比,低、中、高3個(gè)LPS劑量組烏雞FASmRNA在脂肪中的表達(dá)量分別下降32%,49%和83%,在肌肉中的表達(dá)量分別下降14%,37%和51%,差異均達(dá)極顯著水平。在烏雞的脂肪和肌肉中,低、中、高3個(gè)LPS劑量組ACCmRNA表達(dá)量較對(duì)照組分別下降33%,40%和53%及19%,30%和35%,差異均達(dá)極顯著水平,在烏雞肌肉中,低、中、高3個(gè)LPS劑量組PPARαmRNA表達(dá)量較對(duì)照組分別上升了54%,133%和79%;脂肪中未檢測(cè)到PPARαmRNA。與對(duì)照組相比,低、中、高3個(gè)LPS劑量組烏雞脂肪中CPT-1mRNA表達(dá)量分別下降了7%,16%和18%,肌肉中則分別下降了3%,9%和15%,差異達(dá)顯著或極顯著水平。與對(duì)照組相比,低、中、高3個(gè)LPS劑量組烏雞的脂肪和肌肉中LPLmRNA表達(dá)量分別上升了41%,75%和39%及46%,54%和21%,差異均達(dá)極顯著水平。通過(guò)這些脂肪代謝調(diào)控基因的不同變化分析認(rèn)為,LPS感染可能抑制烏雞體內(nèi)的脂肪生成和沉積,而脂肪的分解得到一定的增強(qiáng)。2.6兩組比率比較圖3顯示,試驗(yàn)組烏雞脂肪和肌肉中FAS/CPT-1mRNA比率極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)合圖2結(jié)果可知,低劑量LPS刺激使烏雞體內(nèi)的脂肪酸更多地用于β氧化以維持機(jī)體的能量消耗,但高劑量LPS會(huì)使CPT-1表達(dá)下降并全面抑制能量代謝。2.7fatp1mrna的表達(dá)量由圖4可見(jiàn),FATP1、FATP4、FABP和FAT/CD36的mRNA表達(dá)量受到LPS感染的影響,呈現(xiàn)出不同的變化模式。與對(duì)照組相比,低、中、高LPS劑量組FATP1mRNA在烏雞脂肪組織中的表達(dá)量分別下調(diào)35%,51%和84%;低、中、高LPS劑量組FATP4mRNA表達(dá)量分別下調(diào)9%,12%和29%;FABPmRNA表達(dá)量在低劑量和中劑量LPS組分別上升了42%和10%,但在高劑量LPS組則下降了31%;FAT/CD36mRNA表達(dá)量在低、中、高LPS劑量組分別上升了84%,171%和49%。3討論3.1lps對(duì)雞的一般情況的影響早期關(guān)于LPS對(duì)動(dòng)物影響的研究主要集中在哺乳動(dòng)物上。近年來(lái),關(guān)于LPS對(duì)禽類(lèi)的影響也有一些報(bào)道,如有研究發(fā)現(xiàn),LPS處理明顯引起禽類(lèi)的生理和代謝發(fā)生變化;禽類(lèi)對(duì)LPS引起的病理反應(yīng)具有較強(qiáng)的抵御力,使用大劑量的LPS進(jìn)行處理,雞也能在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)健康。另有研究發(fā)現(xiàn),不同品系的雞對(duì)LPS引起的生理和遺傳表觀變化具有不同的耐受力。本試驗(yàn)中,不同劑量的LPS處理后烏雞均出現(xiàn)困倦、腹瀉、采食量下降、體溫升高等癥狀,試驗(yàn)期LPS處理組烏雞泄殖腔溫度極顯著高于對(duì)照組,生產(chǎn)性能明顯下降,平均體質(zhì)量、日增質(zhì)量均極顯著低于對(duì)照組,而且隨著LPS劑量的增大下降趨勢(shì)更加明顯,這一結(jié)果與Xie等的研究結(jié)果基本一致。分析認(rèn)為,這種生產(chǎn)性能大幅度的下降可能是由于,LPS處理引起烏雞采食量下降以及腹瀉、代謝障礙等多方面原因造成的。對(duì)體脂和血脂的檢測(cè)結(jié)果表明,LPS處理組烏雞體內(nèi)的脂肪含量均低于對(duì)照組,且呈現(xiàn)LPS劑量依賴性下降,這一結(jié)果與董曉玲等的報(bào)道一致。通過(guò)對(duì)LPS引起的敗血癥進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),小鼠脂肪組織和心臟中的脂肪酸氧化代謝減弱,酮類(lèi)產(chǎn)物減少,而肝臟中脂肪酸合成和重酯化得到加強(qiáng)。而本試驗(yàn)中,各LPS處理組烏雞血清中的TC、LDL-C、HDL-C濃度均出現(xiàn)不同程度的減少。Curtis等研究認(rèn)為,LPS導(dǎo)致的雞血脂含量的減少與大腸埃希菌活菌感染引起的血漿脂類(lèi)變化相似,與本研究結(jié)果基本一致。此外,LPS處理引起了烏雞血液中TG和FFA增加,這可能是由于LPS引起機(jī)體內(nèi)大量脂蛋白分解造成的,并且還有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌感染會(huì)大量產(chǎn)生的促炎癥因子TNFα,能夠刺激脂肪細(xì)胞釋放出游離脂肪酸。對(duì)酶活性的檢測(cè)表明,LPS處理組烏雞血清中的脂肪酶、脂蛋白脂酶、肝脂酶的活性都極顯著高于對(duì)照組,這些主要負(fù)責(zé)催化脂類(lèi)水解的酶活性的變化進(jìn)一步提示LPS感染使體內(nèi)脂類(lèi)的分解代謝加強(qiáng)。3.2低劑量lps對(duì)雞代謝的影響FAS是脂肪酸合成的主要限制酶,其活性的高低直接控制著脂肪合成的強(qiáng)弱。ACC則主要催化脂肪酸合成的前體底物丙二酰輔酶A的生成。本研究發(fā)現(xiàn),LPS處理組烏雞的脂肪和肌肉中的FAS和ACCmRNA表達(dá)水平較對(duì)照均極顯著下降(P<0.01),且有LPS劑量依賴性。這兩者的變化在一定程度上說(shuō)明,LPS感染后烏雞體內(nèi)的脂肪酸合成減少,并進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪沉積量的減少。位于線粒體膜上的CPT-1控制著脂肪酸進(jìn)入線粒體的速度,是脂肪酸β氧化的主要限速酶。LPL則主要催化甘油酸三酯水解成甘油和脂肪酸。本研究發(fā)現(xiàn),LPS感染使烏雞的脂肪和肌肉中CPT-1基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的LPS劑量依賴性降低。與此相似,Memon等研究表明,LPS感染會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A的濃度,而該輔酶濃度的升高會(huì)抑制CPT-1的活性。與CPT-1不同,處理組烏雞LPLmRNA水平極顯著高于對(duì)照組,且在中劑量LPS組達(dá)到最大。推測(cè)認(rèn)為,用低劑量LPS處理時(shí),烏雞能量需求升高,造成LPL表達(dá)升高,以滿足能量的需要,但高劑量LPS則造成烏雞的生理機(jī)能?chē)?yán)重下降,體內(nèi)蛋白合成與活性均受到抑制。這些變化提示,LPS感染使體內(nèi)脂肪酸的氧化減弱而脂類(lèi)的分解得到加強(qiáng),這些結(jié)論與Kenneth等的研究結(jié)果吻合。此外,雖然LPS處理組烏雞FAS和CPT-1mRNA水平都下降,但FAS/CPT-1mRNA比率在3個(gè)試驗(yàn)組中均明顯下降,提示機(jī)體內(nèi)脂肪酸的合成強(qiáng)度弱于其氧化。PPARα通過(guò)配體激活調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂和糖代謝多個(gè)基因的表達(dá),對(duì)動(dòng)物機(jī)體能量的穩(wěn)態(tài)平衡起到關(guān)鍵性調(diào)控