總RNA提取、RT-PCR制備cDNA及質(zhì)粒提取與酶切課件

實(shí)驗(yàn)三總RNA提取、RT-PCR制備cDNA及質(zhì)粒提取與酶切TotalRNAPreparation,cDNApreparationbyRT-PCR,plasmidextractionanddigestionbyrestrictionenzymesCompany

Logo基本操作流程實(shí)驗(yàn)三和實(shí)驗(yàn)四是以獲取純化的表達(dá)蛋白質(zhì)為目的，從RNA提取開(kāi)始，經(jīng)過(guò)RT-PCR獲取特定基因的cDNA片斷，再進(jìn)行重組、篩選獲取克隆，最后進(jìn)行基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和檢測(cè)。3質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定Company

Logo1.小鼠腦總RNA的提?。?.RNA含量測(cè)定；3.RT-PCR第一天第二天1.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA及PCR產(chǎn)物第三天2.感受態(tài)細(xì)菌的制備；3.細(xì)菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取與酶切Company

Logo1.小鼠腦總RNA的提??；2.RNA含量測(cè)定；3.RT-PCR第一天RT-PCR的原理及應(yīng)用RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)原理：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。Company

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實(shí)驗(yàn)原理RNA提取注意事項(xiàng)RNA酶易復(fù)活，不易徹底去除，使RNA極易降解。因此，在提取、保存、使用RNA的過(guò)程中，必須時(shí)刻注意防止RNA酶污染問(wèn)題。所有與RNA接觸的試劑、器材都需要去RNA酶處理。一般金屬、玻璃制品可以于160oC加熱2-6小時(shí)；塑料制品可以用氯仿、過(guò)氧化氫、DEPC處理；試劑和水可以用DEPC處理，然后再高壓消毒除去殘留的DEPC。此外，在操作方面需要注意快捷，組織提取速度要快。Company

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實(shí)驗(yàn)原理TRIZOL提取總RNA原理Trizol試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過(guò)程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA。用這種方法得到的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少，可以用來(lái)做Northern,RT-PCR,分離mRNA，體外翻譯和分子克隆等。裂解細(xì)胞,釋放其中RNA使用氯仿使其分三層:上層水相RNA,中間白色是DNA,而下層是蛋白質(zhì),然后使用酚去除蛋白質(zhì)以及DNACompany

LogoRNA質(zhì)量檢測(cè)與鑒定

方法一檢測(cè)RNA溶液的吸光度

測(cè)定OD260/OD280（Ratio，R）：

R=1.8~2.0時(shí)，RNA質(zhì)量較好。

R<1.8時(shí)，RNA有蛋白或者其他有機(jī)物的污染。R>2.2時(shí)，RNA已經(jīng)水解。

方法二RNA的電泳圖譜

用普通的瓊脂糖膠檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和它們的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好。RT-PCR一步法兩步法Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作（第一天）一、從組織中一步法分離總RNA

TotalRNAisolationfromtissuesbyOne-StepRNAPurificationMethod1.每實(shí)驗(yàn)臺(tái)玻璃勻漿器中加入2ml的TRIZOL試劑置冰上待用。2.取鼠腦：脫頸椎處死小鼠，取出小鼠大腦，均分4份，每份約0.2-0.3g（取出肝臟-20℃凍存）（1只鼠/室）3.勻漿：腦組織立即移入玻璃勻漿器中（注意帶手套，勻漿速度緩和，防止試劑噴濺），冰浴中研磨十次左右（至看不到組織塊為止）。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作4.提取腦組織RNA勻漿液平均轉(zhuǎn)移入2只1.5ml離心管中（4人/組），室溫靜置5分鐘。加入0.6ml氯仿，用力顛倒離心管3-5次混合，室溫再靜置5min。

12000rpm離心10min；將上層水相分別轉(zhuǎn)移入各自1.5ml潔凈離心管，每只約400μL（轉(zhuǎn)移時(shí)切勿碰觸蛋白質(zhì)層）。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作

水相中加入400μL異丙醇，顛倒混勻后-20℃（或冰上）靜置10min，

15000rpm離心5min。棄上清，加入1mLDEPC處理過(guò)的75%乙醇，振蕩片刻，15000rpm離心3min；棄上清，敞口室溫靜置使RNA沉淀略干。每管中加入DEPC處理過(guò)的蒸餾水50μL溶解RNA，4℃保存?zhèn)溆?。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作二、RNA含量的紫外分光光度計(jì)測(cè)定

DeterminationofRNAcontentsbyUV-Spectrometer取兩只比色杯，一只加入1500μLDEPC處理過(guò)的蒸餾水，再加入6μLRNA液（稀釋體積視實(shí)驗(yàn)室配備分光光度計(jì)而定）；一只加入1.5mLDEPC處理過(guò)的蒸餾水?；靹蚝笾米贤夥止夤舛扔?jì)中，分別測(cè)定其在260nm和280nm的光吸收值，計(jì)算出二者的比值與RNA溶液濃度。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作三、一步法RT-PCR制備cDNA

cDNAPreparationbyOne-StepRT-PCRRT-PCR采用一步RT-PCR試劑盒（TransGenBiotech)每組取一薄壁200uL反應(yīng)管反應(yīng)體系體積RNATemplateXμL（1mg）ForwardPrimer1mLReversePrimer1mL2×HiFiPCRSuperMixⅡ25mLOne-stepEnzymeMix1mLRNase-freeWaterto50mLCompany

Logo實(shí)驗(yàn)操作45℃30min水浴箱PCR儀：94℃2min94℃30sec55℃30sec進(jìn)行30次循環(huán)72℃180sec72℃5min反應(yīng)條件Company

Logo第二天瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢查RNA及PCR產(chǎn)物；感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化Company

LogoDNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)分離的DNA大小及類(lèi)型的不同，DNA電泳主要分兩類(lèi)：（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳

適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達(dá)1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進(jìn)行純化，也稱(chēng)PAGE純化。

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LogoDNA瓊脂糖凝膠電泳

（2）瓊脂糖凝膠電泳

可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.5～0.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp～50kb。電泳結(jié)果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為ng級(jí)，而且整個(gè)過(guò)程一般1小時(shí)內(nèi)即可完成。由于該方法操作的簡(jiǎn)便和快速，在基因工程中較常用。Company

Logo瓊脂糖凝膠

瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型β-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿α-L-半乳糖組成，形成相對(duì)分子量為104～105的長(zhǎng)鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時(shí)鏈間糖分子上的羥基通過(guò)氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。DNA瓊脂糖凝膠電泳Company

Logo感受態(tài)細(xì)菌的制備大腸桿菌經(jīng)過(guò)處理后可以攝取外源DNA（PlasmidDNA、PhageDNA等），處于這種狀態(tài)的細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞（CompetentCell）。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌懸浮于冰冷的CaCl2溶液中。經(jīng)冰育一段時(shí)間后，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞就具備了感受態(tài)特性，此時(shí)加入外源DNA，經(jīng)42℃短暫熱處理后，外源DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。Company

Logo感受態(tài)細(xì)胞（CompetentCell）Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作(第二天)在RT-PCR反應(yīng)管中加入適量10×上樣液（約1μL），用于電泳。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作一、RNA及RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

AgaroseGelElectrophoresis1.制備0.8%瓊脂糖凝膠，加熒光染料其終濃度為0.5ug／m1。2.電泳：按下表上樣，80V,30min，紫外燈下觀察結(jié)果?？俁NA10mg/孔上樣，PCR產(chǎn)物10~15mL上樣。MRNAPCR第一組第二組第三組第四組RNAPCRRNAPCRRNAPCRCompany

Logo實(shí)驗(yàn)操作3.RNA變性瓊脂糖電泳（制膠參見(jiàn)P.57）4.電泳：按下表上樣，總RNA10mg/孔上樣，80V,30min，紫外燈下觀察結(jié)果。MRNARNA第一組第二組第三組第四組RNARNARNARNARNARNACompany

Logo實(shí)驗(yàn)操作（第二天）二、感受態(tài)細(xì)菌制備（P.78）PreparationofCompetentBacteria1.細(xì)菌劃盤(pán)培養(yǎng)：取一不含抗菌素的LB培養(yǎng)皿，將接種環(huán)于酒精燈上燒灼滅菌，冷卻后蘸取菌種于培養(yǎng)基上劃線，然后將培養(yǎng)皿倒扣置37℃溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)，第二天早上取出置室溫待用。2.細(xì)菌過(guò)夜液態(tài)培養(yǎng)：第二天下午5點(diǎn)左右，取經(jīng)過(guò)高壓消毒的MA培養(yǎng)液10mL移入一100mL容積的三角燒瓶，加四環(huán)素至終濃度為10ug/mL；用200ml移液器從培養(yǎng)皿上取一個(gè)菌落接種于其中，37℃230rpm振搖過(guò)夜。第三天，將100μl過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移入10mlSOB培養(yǎng)液中，繼續(xù)于37oC230rpm振搖培養(yǎng)3-4hr，至菌液的OD600nm=0.4-0.6（細(xì)菌的指數(shù)生長(zhǎng)期）。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作3.感受態(tài)細(xì)菌制備（每室制備4份）

取一1.5mL離心管（分別標(biāo)記為管1、2），各加入1.4mL培養(yǎng)細(xì)菌，冰浴中冷卻10min后于4℃15000rpm離心1min，去凈上清。加入0.4mL感受態(tài)制備液A，上下吹吸懸浮細(xì)菌，然后置冰上15min；4℃，15000rpm離心1min，去凈上清。加入100μL感受態(tài)制備液B，上下吹吸懸浮細(xì)菌，混勻后置冰浴10min待用。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作細(xì)菌轉(zhuǎn)化（4人/組，每組一個(gè)培養(yǎng)板）

TransformationofBacteria1.向感受態(tài)細(xì)菌管1中加入4μL連接反應(yīng)液，向感受態(tài)細(xì)菌管2中加入1ul的質(zhì)粒DNA，混勻后置冰浴中靜置30min；然后移入42℃熱休克處理1.5min；再移入冰浴靜置5min。

2.向各管中加入900μLSOC培養(yǎng)液，顛倒混勻，置37℃保溫60min，每15min顛倒混勻一次。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照每室一份。Company

Logo實(shí)驗(yàn)操作3.鋪板（盤(pán)）：對(duì)應(yīng)于每一轉(zhuǎn)化反應(yīng)取兩個(gè)含抗生素的MA培養(yǎng)皿，標(biāo)記上組號(hào)和反應(yīng)號(hào)，先將全部培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入一培養(yǎng)皿，然后使其均勻分布于全平皿，再傾斜吸出多余的菌液移入第二個(gè)平皿中，同樣處理使菌液均勻分布于培養(yǎng)皿上。4.過(guò)夜培養(yǎng)：將第一個(gè)培養(yǎng)皿倒扣，第二個(gè)培養(yǎng)皿正置于37℃溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，取出培養(yǎng)皿，挑選菌落進(jìn)行培養(yǎng)、提取DNA、和篩選；或者用封口膜封住培養(yǎng)皿，置4℃可以保存1-2星期。蛋白激酶C

目前為止，在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)已確定10種PKC亞類(lèi)，分為A、B、C三組，A組稱(chēng)為典型或傳統(tǒng)的PKC（classicalorconventionalPKC,CPKC），包括α、βI、βⅡ和γ亞類(lèi)，其中βI和βⅡ有高度的同源性，是由同一mRNA的不同剪接而成，A組成員分子量在76-78kDa。B組為新型PKC（atypicalPKC,aPKC），包括δ、ε、η（L）和θ亞類(lèi)，分子量在77-83kDa。C組為非典型PKC（atypicalPKC,aPKC），由ζ和λ亞類(lèi)組成，分子量較小為67kDa。實(shí)驗(yàn)原理哺乳動(dòng)物組織內(nèi)的PKC亞類(lèi)亞

類(lèi)氨基酸殘基分子量（kDa）激

活

劑表達(dá)組織A組：經(jīng)典PKC

α67276PS、Ca2+、DAG、FFA、LysoPC廣泛βI67176同

上某些組織βⅡ67376同

上多種組織γ69778同

上腦B組：新型PKC

δ67377PS、DAG廣

泛ε73783PS、DAG、FFA腦

等η（L）68377？肺、皮膚、心臟θ70781？骨骼肌C組：非典型PKC

ζ59267PS、FFA廣

泛λ58667？卵巢、睪丸等實(shí)驗(yàn)原理載體pUC18-GFP：3.4kbGFPampr實(shí)驗(yàn)原理重組體pUC18-GFP-pKC：4.5kbGFPpKCεampr6-HisUAG6-HispKC表達(dá)產(chǎn)物：融合蛋白（40KD)實(shí)驗(yàn)原理HindⅢ12435酶切鑒定的原理重組體上有3個(gè)HindⅢ的酶切位點(diǎn)正向：1+2(1.3kb)；3+4(430)；5反向：1+3(790)；2+4(950)；5空載：1+4(620)；5實(shí)驗(yàn)原理1（490）；2（820）；3（300）4（130）；5（2.7kb）綠色熒光蛋白（GFP)

綠色熒光蛋白-發(fā)現(xiàn)日本科學(xué)家下村脩1962年在普林斯頓大學(xué)做研究的時(shí)候，從一種特殊水母中提取水母素時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)一種在紫外光下可以發(fā)強(qiáng)烈綠色的蛋白─綠色熒光蛋白(GFP)。發(fā)光原理其基因可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光，GFPcDNA開(kāi)放閱讀框架長(zhǎng)度約714bp，編碼238個(gè)氨基酸殘基，其肽鏈內(nèi)部第65-67位絲氨酸－脫氫酪氨酸－甘氨酸通過(guò)自身環(huán)化和氧化形成一個(gè)發(fā)色基團(tuán)，在長(zhǎng)紫外波長(zhǎng)或藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。實(shí)驗(yàn)原理GFP的優(yōu)點(diǎn)

(1)易于檢測(cè)。GFP熒光反應(yīng)不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對(duì)于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別。

(2)熒光穩(wěn)定。GFP對(duì)光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長(zhǎng)時(shí)間的光照GFP在pH7~12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光；對(duì)高溫(70℃)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)都有較強(qiáng)抗性?！?/p>

(3)無(wú)毒害。從目前的研究結(jié)果來(lái)看，GFP對(duì)生活的細(xì)胞基本無(wú)毒害，對(duì)目的基因的功能也沒(méi)有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。實(shí)驗(yàn)原理GFP的優(yōu)點(diǎn)(4)通用性。表現(xiàn)在GFP的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動(dòng)物中都獲得了成功的表達(dá)；其次是GFP沒(méi)有細(xì)胞種類(lèi)和位置上的限制，在各個(gè)部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光。(5)易于構(gòu)建載體。由于GFP分子量較小，僅為27~30kD，編碼GFP的基因序列也很短，為2．6kb，所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過(guò)大影響轉(zhuǎn)化頻率。實(shí)驗(yàn)原理

GFP的應(yīng)用

研究基因表達(dá)的調(diào)控元件和蛋白定位。

?研究基因表達(dá)的時(shí)序控制與空間定位。

?發(fā)育分子機(jī)理研究。GFP可以作為活體標(biāo)記，在原位觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)。特別對(duì)于身體透明的動(dòng)物觀察起來(lái)更方便。

?篩選藥物。由于可以用不同顏色的GFP衍生物標(biāo)記相關(guān)的蛋白，來(lái)觀察單細(xì)胞內(nèi)相互作用的靶蛋白，再分離出目的細(xì)胞，從而可用于大規(guī)模藥物篩選。

?臨床檢驗(yàn)。生產(chǎn)出GFP標(biāo)記的抗原或抗體，就可以免疫診斷。實(shí)驗(yàn)原理?轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物的篩選標(biāo)記，微生物在體內(nèi)的感染途徑，病毒和宿主的相互作用等。如將其插入動(dòng)物、細(xì)菌或細(xì)胞的遺傳信息中,隨著細(xì)胞復(fù)制,可觀察不斷長(zhǎng)大的癌癥腫瘤、細(xì)菌的生長(zhǎng)等等。

?GFP的用途已經(jīng)擴(kuò)展到藝術(shù)和商務(wù)領(lǐng)域。育種工作者利用GFP來(lái)創(chuàng)造特殊的熒光植物，花卉和各種魚(yú)類(lèi)，GFP已經(jīng)被移植到大鼠、老鼠、青蛙、有翅昆蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)以及不計(jì)其數(shù)的其它生物體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒提取的原理（堿裂解法）實(shí)驗(yàn)原理Company

Logo質(zhì)粒DNA提取空載體DNA和重組DNA限制酶切鑒定質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定獨(dú)立存在于細(xì)菌染色體外、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，能自我復(fù)制的、呈共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小分子量的DNA分子。具有自我復(fù)制功能；具有抗性基因、表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物；具有多克隆位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciples)DH5a1、質(zhì)粒(plasmid)質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciples)2、質(zhì)粒DNA提取溶液I:50mM葡萄糖,25mMTris-Cl,10mMEDTA，pH8.0；（溶菌酶、RNase）溶液II:0.2MNaOH,1%SDS；溶液III:3M醋酸鉀,2M醋酸。

47質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定溶液I(葡萄糖+Tris+EDTA)溶液II(NaOH+SDS)溶液III(醋酸鉀+醋酸)2、質(zhì)粒DNA提取/異戊醇質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定

基因工程的手術(shù)刀是分子生物學(xué)研究中的一種工具酶，能識(shí)別特異的DNA序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。（切：水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵

）根據(jù)其識(shí)別切割的特性，可分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三型。3、限制性核酸內(nèi)切酶質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn):識(shí)別及切割位點(diǎn)相同識(shí)別序列通常為4～8bp的回文結(jié)構(gòu)切割可產(chǎn)生兩類(lèi)切口，三種末端3、限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠNdeI質(zhì)粒DNA提取及酶切鑒定BamHⅠGTCCAGGCCTAGGAT