分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究芬太尼類化合物與阿片受體的相互作用

分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究芬太尼類化合物與阿片受體的相互作用

apollo營養(yǎng)元素是apollo酶o的主要亞型之一。現(xiàn)在，這三種亞狀體的基因已被克隆。根據(jù)研究，選擇性激動(dòng)劑激活脊柱和脊柱受體，可能會(huì)產(chǎn)生一些生理效應(yīng)，尤其是疼痛、付款效應(yīng)、心率減慢、呼吸抑制、腸蠕動(dòng)抑制、甚至癱瘓和中毒。經(jīng)典的apo三種受體激動(dòng)劑和椰子醇是它們的抗劑。apo受體屬于g蛋白偶聯(lián)體（gcl）。apsr具有相同的基本結(jié)構(gòu)，即一個(gè)細(xì)胞外氨基端區(qū)域、七個(gè)半膜區(qū)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)羥基端端末年。芬太尼(fentanyl)學(xué)名為1-苯乙基-4-(N-丙酰苯胺)哌啶,為阿片類鎮(zhèn)痛藥,它的鎮(zhèn)痛效力約為嗎啡的100-180倍,哌替啶的550-1000倍,并具有毒性低、對(duì)循環(huán)影響小、時(shí)效短(15-30min)、容易控制、術(shù)后自主呼吸恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn),故近年來越來越受到人們的重視.芬太尼、舒芬太尼和阿芬太尼等芬太尼類配體藥效增強(qiáng)、起效迅速、作用消失快,靜脈滴注容易控制止痛劑量、安全可靠.關(guān)于芬太尼類激動(dòng)劑與阿片μ受體選擇性結(jié)合的分子作用機(jī)制的詳細(xì)研究報(bào)道不多,目前對(duì)芬太尼活性構(gòu)象的報(bào)道中發(fā)現(xiàn),芬太尼結(jié)構(gòu)中的N-苯乙基和N-苯基基團(tuán)的取向?qū)钚詷?gòu)象貢獻(xiàn)較大.本文采用芬太尼及本課題組設(shè)計(jì)的小分子配體與阿片μ受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬,以研究配體與蛋白間的疏水作用、氫鍵作用等關(guān)系,探討其分子作用機(jī)制,對(duì)輔助設(shè)計(jì)新型高效鎮(zhèn)痛劑和其他特殊用途的化合物有一定的意義.1模型和計(jì)算方法1.1結(jié)構(gòu)1:gpcr受體分子動(dòng)力學(xué)模擬我們前期的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,故阿片μ受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)采用Zhang等用同源模建方法搭建的結(jié)構(gòu).該結(jié)構(gòu)以具有高解析度的視紫紅激酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)為模板(PDB代碼為:1F88).一般的GPCR受體經(jīng)過同源建模后需要進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化,目前,GPCR受體的MD模擬方法有兩種,一種是先構(gòu)建蛋白與脂水膜體系,然后用MD研究整個(gè)蛋白-膜-水體系.另一種是構(gòu)建蛋白-水體系,主要用來研究配體結(jié)合性.本文采用后一種方法.1.2受體的遺傳算法在IBMIntelliStationPOWER工作站上,采用AutoDock4.0程序?qū)?2個(gè)芬太尼受體激動(dòng)劑小分子與阿片μ受體進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接參數(shù):受體大分子的格點(diǎn)盒子大小為8nm×8nm×8nm,格點(diǎn)間距為0.0375nm,盒子中心位于受體中心,運(yùn)用Lamarckian遺傳算法,將局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合,以半經(jīng)驗(yàn)勢函數(shù)作為能量打分函數(shù),對(duì)小分子構(gòu)象和位置進(jìn)行全局搜索,對(duì)每個(gè)配體進(jìn)行128次獨(dú)立的對(duì)接實(shí)驗(yàn).遺傳算法程序關(guān)鍵參數(shù)為ga_pop_size300ga_num_evals2500000,ga_run=100,最后依據(jù)最低對(duì)接能和成簇分析的情況,選取合理的受體配體結(jié)合模式作為初步的復(fù)合物結(jié)構(gòu).1.3結(jié)構(gòu)的提取和分子對(duì)接操作將MD模擬后得到的受體再次與配體進(jìn)行對(duì)接,復(fù)合物的結(jié)構(gòu)取MD達(dá)到穩(wěn)態(tài)后的平均構(gòu)象然后從復(fù)合物結(jié)構(gòu)中提取出受體結(jié)構(gòu)和配體結(jié)構(gòu)再以新得到的受體按1.2節(jié)中的方法進(jìn)行分子對(duì)接操作.1.4激動(dòng)劑-溶劑-水gc-ms的系統(tǒng)優(yōu)化方法用GROMACS程序包分別在水溶液體系中對(duì)12個(gè)芬太尼受體激動(dòng)劑和阿片μ受體蛋白受體復(fù)合物進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬研究.12個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)為1.2節(jié)所述對(duì)接的結(jié)果.每個(gè)復(fù)合物的質(zhì)心位于立方體盒子中心,選擇溶質(zhì)原子到盒子壁的距離為0.7nm,然后加入水分子,水分子選用SPC模型采用GROMACS全原子力場,用2fs積分步長,用最陡下降法進(jìn)行了1000步的能量優(yōu)化,然后在300K下進(jìn)行了10000步的限制性動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,最后采用2fs的步長,使用熱浴耦合使系統(tǒng)溫度保持在300K,用Maxwell分布產(chǎn)生.每隔100步記錄一次軌跡在MD模擬中,用PME(Particle-MeshEwaldelectrostatics)方法處理靜電作用,范德華相互作用截?cái)喟霃饺?.9nm,用SUNWAY計(jì)算機(jī)集群并行計(jì)算模擬1200ps,直到能量達(dá)到穩(wěn)態(tài)為止.分別對(duì)蛋白環(huán)境和溶劑環(huán)境下激動(dòng)劑與環(huán)境之間相互作用能進(jìn)行系綜平均,從而計(jì)算出受體-配體結(jié)合自由能(△G)和結(jié)合常數(shù)(Ki).1.5劑能量項(xiàng)采用了MM-PBSA(molecularmechanicsPoissonBoltzmannsurfacearea)方法計(jì)算復(fù)合物結(jié)合自由能,此方法采用分子力學(xué)和連續(xù)介質(zhì)模型估算復(fù)合物的結(jié)合自由能,并采用修正后的RobertYang的Perl腳本處理構(gòu)象,修正后的腳本排除了程序中讀取錯(cuò)誤.MM-PBSA方法的計(jì)算方程式:式(1)可以分為氣相能量項(xiàng)和溶劑能量項(xiàng),氣相能量項(xiàng)包含內(nèi)能項(xiàng)(EMM)和熵部分(TSMM)項(xiàng);溶劑能量項(xiàng)Gsolv可以分為極性(Gpolar,solv)和非極性(Gnon-polar,solv)項(xiàng),見式(2).用MD模擬后提取能量文件中的蛋白-蛋白電性和vanderWaals相互作用而得到EMM項(xiàng).參考了文獻(xiàn)中的方法考慮了在對(duì)接研究中不同復(fù)合物的熵相同而忽略了熵部分TSMM項(xiàng).本文根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果,計(jì)算復(fù)合物加權(quán)協(xié)方差矩陣再計(jì)算其熵部分?jǐn)?shù)值.極性和非極性項(xiàng)的計(jì)算則采用APBS軟件包,其電性項(xiàng)的參數(shù)grid-spacing取0.01nm.使用GROMOS9643a1力場參數(shù)設(shè)置原子電荷和半徑,探針半徑0.14nm,復(fù)合物介電常數(shù)設(shè)為1,溶劑的介電常數(shù)設(shè)為80.非極性項(xiàng)Gnon-polar,solv采用溶劑可及表面(SSASA)方法計(jì)算:其中γ=2.2kJ·mol-1·nm-2,β=3.84kJ·mol-1.每個(gè)復(fù)合物采用21個(gè)結(jié)合構(gòu)象,選取方法如下:在全部1200ps模擬中,選取最后200ps為平衡狀態(tài),即從1000ps開始(包含1000ps)取樣,間隔為10ps,選取一個(gè)結(jié)構(gòu),至1200ps結(jié)束,共21個(gè)構(gòu)象,采用這21個(gè)構(gòu)象的極性和非極性項(xiàng)的平均值作為計(jì)算值.2結(jié)果與討論2.1阿片受體三維結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)人類阿片μ受體蛋白有七個(gè)跨膜(TM)區(qū)段,屬于GPCR超家族.該受體由400個(gè)氨基酸殘基組成,TM2、TM3、TM7區(qū)和第2胞內(nèi)環(huán)區(qū)(IL2)具有較高的同源性,而TM1、TM4、TM5區(qū)則同源性較低.第2胞內(nèi)環(huán)和第3胞內(nèi)環(huán)區(qū)(IL2和IL3)是蛋白結(jié)合區(qū)域,這些區(qū)域在三種阿片受體中的高度相似性表明有與蛋白相互作用的可能性.阿片μ受體與κ、δ兩種阿片受體結(jié)構(gòu)的最大差異部分在氨基端、羧基端及第2、3胞外環(huán)區(qū)(EL2和EL3),這些區(qū)域可能是阿片受體配體結(jié)合區(qū),是不同配體選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).該推測已經(jīng)通過直接點(diǎn)突變得到證實(shí).阿片μ受體三維結(jié)構(gòu)見圖1.2.2md模擬結(jié)果通過對(duì)初步的分子對(duì)接結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)芬太尼配體分子間距離0.5nm內(nèi)的參與配體相互作用比較重要的氨基酸有TM1區(qū)段上的Asp114、Ala117;TM3區(qū)段上的氨基酸Ile144、Ser145、Asp147、Tyr148、Asn150、Met151;TM5區(qū)段上的氨基酸His226、Ile230、Tyr234;TM6上Trp293、Asn296、His297、Tyr300、Arg303;TM7區(qū)段上的氨基酸Cys321、Ile322、Gly325、Tyr326等,所有參加作用的氨基酸編號(hào)見表1.12個(gè)芬太尼類衍生物(包括已知活性在內(nèi)的4個(gè)芬太尼類衍生物)和阿片μ受體蛋白的對(duì)接結(jié)果有多種取向和構(gòu)象,按照對(duì)接能量排序,我們發(fā)現(xiàn)低能構(gòu)象多集中于配體質(zhì)子化的N原子正電中心,并與TM3上的Asp147電負(fù)性中心發(fā)生相互作用(如圖2所示),此外還有幾個(gè)主要的作用殘基,分別為TM1的Asp114,TM3的Asp147,和TM6的His297,其中Asp147與芬太尼類衍生物的哌啶季氨正電荷有電性作用,這些研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道是一致的.通過MD模擬研究,我們還發(fā)現(xiàn)復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)與無配體受體結(jié)構(gòu)有較大差異(圖2).因此,我們將MD模擬后得到的受體結(jié)構(gòu)再次與各自配體進(jìn)行分子對(duì)接研究,AutoDock4.0再次對(duì)接后的計(jì)算結(jié)合能結(jié)果見表2.表2計(jì)算結(jié)果顯示,結(jié)合能除羥甲芬太尼(ohmefentanyl)外,其它與實(shí)驗(yàn)活性排序一致.我們分析認(rèn)為,羥甲芬太尼結(jié)構(gòu)中額外的羥基通過水分子介導(dǎo)與Tyr148殘基形成氫鍵(見圖3),而在對(duì)接過程中這個(gè)溶劑分子引入的額外的氫鍵未給予考慮,從而羥甲芬太尼對(duì)接評(píng)分排序與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不一致的.采用MM-PBSA方法,計(jì)算出的12個(gè)芬太尼類衍生物的結(jié)合自由能,以及與它們對(duì)接計(jì)算的結(jié)果對(duì)比見表3.用MM-PBSA方法計(jì)算得到的結(jié)合自由能,不但能夠?qū)σ种苿┑慕Y(jié)合強(qiáng)弱進(jìn)行正確的排序,而且計(jì)算得到的數(shù)值和實(shí)驗(yàn)數(shù)值能夠較好地符合.其中以芬太尼的計(jì)算結(jié)果最為接近,與本文前述AutoDock4.0計(jì)算結(jié)果相比較,MM-PBSA方法計(jì)算結(jié)果更為接近實(shí)驗(yàn)值,但計(jì)算數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)值仍略有偏差,除羥甲芬太尼外,計(jì)算值整體稍微偏高.2.3載鉛樣品的md模擬2.3.1平均構(gòu)象的變化空載受體蛋白在MD模擬過程中均方根偏差(RMSD)值是衡量體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù),α碳(Cα)和骨架的RMSD值在初始的100ps內(nèi)變化大,隨后基本穩(wěn)定.蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)過2000ps的優(yōu)化達(dá)到穩(wěn)態(tài).本課題中以空載受體蛋白在1200ps平衡后的平均構(gòu)象作為分子對(duì)接的基礎(chǔ)構(gòu)象,研究了其內(nèi)能的變化,如圖4所示.結(jié)果表明,體系的內(nèi)能變化不大,在短期模擬后即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),這可能是因?yàn)椴捎玫某跏冀Y(jié)構(gòu)已經(jīng)進(jìn)行了能量優(yōu)化的原因,上述模擬結(jié)果表明我們所得系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài).MD模擬中的Cα空間位置均方根(RMS)漲落是反映分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)特征及柔性的一個(gè)重要參數(shù),RMS值越高,柔性越大,否則相反.從圖5所示的空載受體RMS圖可以看出,全部序列中有7個(gè)跨膜區(qū)段(分別以TM1-TM7標(biāo)示)柔性相對(duì)胞內(nèi)(標(biāo)示為IL)比胞外區(qū)(標(biāo)示為EL)低,其TM4、TM5跨膜區(qū)氨基酸在平衡態(tài)時(shí)仍有一定的柔性.受體蛋白的柔性可用Cα序列位置(δ)的RMS變化來衡量,即觀察蛋白的δ在模擬后與模擬前結(jié)構(gòu)的變化,用位置偏離的RMS均方根偏差來衡量,如果δ的RMS變化較大,說明這些區(qū)段的柔性較大.如圖6所示.2.3.2不同配比的受體結(jié)構(gòu)對(duì)活性構(gòu)象的影響如圖7所示,以芬太尼受體復(fù)合物為例的所有復(fù)合物分子的模擬,總能量和勢能都很快達(dá)到穩(wěn)態(tài)狀態(tài).在開始的500ps內(nèi),RMSD變化稍大,500ps后通過RMSD值變化可知,已基本達(dá)到平衡狀態(tài)(圖7(b)).這說明復(fù)合物體系已經(jīng)穩(wěn)定.分析復(fù)合物的RMS數(shù)據(jù)(圖8)發(fā)現(xiàn),受體柔性較大的片段為TM1、TM4、TM5跨膜區(qū)段,而對(duì)活性口袋具有主要貢獻(xiàn)的TM2、TM3、TM6、TM7跨膜區(qū)段,結(jié)構(gòu)柔性較低,比較穩(wěn)定.將芬太尼復(fù)合物蛋白部分在1200ps內(nèi)的Cα與空載配體受體結(jié)構(gòu)Cα比較得知,復(fù)合物跨膜區(qū)段IL2、IL3(胞內(nèi)區(qū)段)和TM4區(qū)段構(gòu)象變化較大.分析復(fù)合物的RMS變化(圖8、圖9),發(fā)現(xiàn)結(jié)合配體后,受體TM1、TM3、TM6、TM7區(qū)段柔性降低(圖8),而IL2、IL3(胞內(nèi)區(qū)段)EL3(胞外區(qū)段)和TM4的部分區(qū)段柔性增加,這說明配體能夠穩(wěn)定受體TM1、TM3、TM6、TM7的構(gòu)象,通過改變增加部分區(qū)段構(gòu)象和柔性來激活受體,配體對(duì)受體結(jié)構(gòu)的影響不僅僅在活性區(qū),可能還通過一系列構(gòu)象和柔性變化影響到整個(gè)受體的功能,從而使蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詷?gòu)象而發(fā)揮作用.我們前期通過構(gòu)效關(guān)系和受體分子藥理學(xué)研究表明,受體蛋白活性中心的變化影響生理活性的大小,最可能僅對(duì)剛性受體而言是正確的.本研究表明,對(duì)大多數(shù)柔性受體來說,非活性中心構(gòu)象的變化也將影響整個(gè)受體的活性構(gòu)象及其與藥物分子的相互作用,影響到藥物分子的生物活性.不同配體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)RMS變化有差異.Carfentanil24結(jié)合受體后,受體的TM6、TM7區(qū)段RMS變化小,結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,而IL2、IL3、EL3、TM4部分區(qū)段的RMS較高(如圖10所示),實(shí)驗(yàn)值較好的化合物在穩(wěn)定TM6、TM7區(qū)段跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的同時(shí),還增加了其他蛋白區(qū)段的柔性,這些區(qū)段柔性和構(gòu)象的改變可能與蛋白功能有關(guān).與受體結(jié)合能較低的配體2、21、22與受體結(jié)合后,受體各個(gè)區(qū)段的RMS變化都呈下降趨勢,柔性降低(圖11).這種變化說明配體2、21、22與受體結(jié)合后,使得受體結(jié)構(gòu)柔性整體降低,但是由于TM4、IL2、IL3柔性可能與活性構(gòu)象有關(guān),柔性整體降低不利于蛋白向活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變從而降低了活性.2.3.3風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的添加突變數(shù)據(jù)和分子對(duì)接的結(jié)果都表明TM2,TM3,TM7跨膜區(qū)段都參與了同配體的結(jié)合,因此有必要重點(diǎn)分析構(gòu)成活性口袋的螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)變化.如圖12所示,分析結(jié)合配體后受體螺旋區(qū)的RMSD的變化,發(fā)現(xiàn)結(jié)合配體后受體TM4、TM5的RMSD波動(dòng)較其他的幾個(gè)螺旋顯著.我們還分析了經(jīng)歷同樣的MD模擬后,復(fù)合物和空載受體結(jié)構(gòu)中氫鍵數(shù)量的變化,發(fā)現(xiàn)結(jié)合配體后,受體螺旋區(qū)的氫鍵除TM5區(qū)段外,其他區(qū)段的氫鍵數(shù)量稍有增加,特別是在TM4片段,比空載受體增加了兩對(duì)氫鍵的相互作用,這與RMS變化分析中結(jié)合配體后引發(fā)TM4區(qū)段的變化相一致,而結(jié)合配體后整個(gè)體系氫鍵的相互作用增加,復(fù)合物與空載受體氫鍵數(shù)量比為63比55,見表4.在空載受體TM1和TM7、TM2和TM7、TM2和TM3、TM5和TM6與TM6和TM7之間都有氫鍵的形成.經(jīng)過分析,這些螺旋之間形成氫鍵的現(xiàn)象在G蛋白偶聯(lián)受體家族中是普遍存在的.在結(jié)合配體之后,TM1和TM7、TM2和TM7、TM2和TM3、TM5和TM6跨膜區(qū)段之間的氫鍵作用消失,TM1和TM2、TM2和TM4跨膜區(qū)段之間的氫鍵作用增加,TM2、TM3、TM7是結(jié)合口袋所在的區(qū)域,我們