egcg對c57bl6小鼠模型的影響

egcg對c57bl6小鼠模型的影響

非脂肪食品。為了探討EGCG與毛發(fā)生長的關系,筆者以C57BL6小鼠作為動物模型,觀察EGCG對小鼠脫發(fā)模型毛發(fā)生長及毛發(fā)周期的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小鼠皮色糯米粉C57BL6小鼠,雌性,8周,15~20g,同系,共24只,中國科學院藥物研究所動物中心提供。選擇皮色粉紅,毛發(fā)屬于休止期的小鼠。C57BL6小鼠的毛發(fā)周期同步,可根據其皮膚顏色判斷毛發(fā)周期的階段變化,毛發(fā)生長期皮膚呈黑色,退行期呈灰色,休止期呈粉紅色。1.1.2主試劑1.2方法1.2.1小鼠背毛消毛將松香與石蠟1:1混合加熱融化后,均勻涂于小鼠背部,涂抹面積約2cm×3cm,冷卻凝固后揭去,以去除背毛。確認毛發(fā)生長期處于休止期。1.2.2動物分組及給藥脫毛次日,選取脫毛區(qū)光滑無皮膚破損的小鼠,隨機分為4組,每組動物數6只。分別是:(1)實驗組:給予8%EGCG乙醇制劑;(2)陽性對照組:給予5%米諾地爾溶液;(3)基質組:給予基質液(乙醇);(4)陰性對照組:不涂抹藥物。1.2.3給藥1.2.4皮膚組織病理學檢測每天觀察小鼠皮膚及毛色變化,記錄每只動物背部去毛區(qū)皮膚顏色從涂藥到開始變黑的時間;陰性對照組記錄脫毛后第1天到開始去毛區(qū)皮膚變黑的時間;去毛區(qū)開始變黑到長滿毛的時間,并定期拍照。第4、12、20天時,取各組小鼠背部相同位置皮膚組織塊,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋切片,切片厚約4~5μm,HE染色,光鏡下觀察。觀察指標如下:(1)一般組織學檢查:觀察皮膚完整性,有無充血、水腫、炎細胞浸潤等反應及程度;(2)毛囊計數,每例數3個高倍視野(×400)的毛囊數,取其均值,并進行統(tǒng)計學處理。1.2.5統(tǒng)計評估2結果2.1皮膚黑色及灰色持續(xù)的時間(1)實驗組小鼠在拔毛后第5~6天局部皮膚逐漸出現黑色,毛發(fā)進入生長期,10天后新的毛發(fā)長出,20天時皮膚顏色又經灰色(退行期)變?yōu)榉奂t色(休止期),皮膚黑色及灰色共持續(xù)約15天;(2)陽性對照組小鼠在拔毛后第5天局部皮膚漸出現黑色,毛發(fā)進入生長期,9天后新的毛發(fā)長出,20天時皮膚顏色又經灰色(退行期)變?yōu)榉奂t色(休止期),皮膚黑色及灰色共持續(xù)15天;(3)基質組、陰性對照組小鼠均在拔毛后第6天局部皮膚由粉紅色變?yōu)楹谏?10天后新的毛發(fā)長出,19天時皮膚顏色又經灰色變?yōu)榉奂t色,皮膚黑色及灰色共持續(xù)13天。2.3小鼠在統(tǒng)計學上的差異實驗第20天,各組小鼠毛囊數目見表1。實驗組、陽性對照組與陰性對照組小鼠在統(tǒng)計學上均具有極顯著性差異,P<0.001,基質組與陰性對照組相比無顯著性差異,P>0.05。且實驗組與陽性對照組相比較無顯著性差異,P>0.05。3皮膚長期毒性作用EGCG是綠茶提取物茶多酚中的一種主要活性單體,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、調節(jié)機體免疫及誘導腫瘤細胞凋亡等作用。研究發(fā)現,EGCG對多種腫瘤細胞增殖表現不同程度的抑制作用,其機制與誘導腫瘤細胞凋亡,誘導腫瘤細胞周期阻滯,對細胞信號傳導通路的影響等有關。也有報道顯示EGCG對正常的表皮角質形成細胞有促增殖作用。2006年Kwon等首次報道了EGCG可促進人毛發(fā)生長。國內李梅云、范衛(wèi)新等研究也發(fā)現一定濃度的EGCG可促進體外培養(yǎng)的人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖。目前國內外未見EGCG對毛發(fā)生長周期影響的相關報道。本研究以C57BL6小鼠為模型,設立陽性對照、陰性對照,觀察外用EGCG溶液對毛發(fā)周期、毛囊密度、毛囊形態(tài)的影響。C57BL6小鼠是研究毛發(fā)周期的動物模型,毛發(fā)呈周期性生長,毛發(fā)周期分生長期、退行期和休止期。。該小鼠毛發(fā)呈黑色,皮膚中的黑素細胞均分布于毛囊,僅在毛發(fā)生長期才合成分泌黑素,并將黑素傳遞給角質形成細胞,使皮膚呈黑色;在毛發(fā)退行期,黑素合成減少,皮膚逐漸由黑色變?yōu)榛疑?休止期無黑素合成,皮膚呈粉紅色。經組織學驗證,該小鼠皮膚顏色的變化能反映毛發(fā)生長周期的不同時段。該小鼠在6~8周飼養(yǎng)良好狀態(tài)下,所有毛囊均由生長期(皮膚黑色)進入休止期(皮膚粉色)狀態(tài),而且在生理狀態(tài)下不再自發(fā)進入生長期,但經人為拔毛后可被誘導進入生長期,拔毛后第5~6天皮膚顏色變黑(生長期第Ⅳ亞期),黑色持續(xù)12天又轉為灰色(退行期),2天后皮膚轉為粉紅色(休止期)。米諾地爾溶液是臨床應用極為廣泛的一種治療各類脫發(fā)的藥物,有研究表明,其可以使毛發(fā)提前進入生長期,延長生長期時間,并縮短休止期,并能使毛囊增大。故本研究選用5%米諾地爾溶液為陽性對照。本實驗發(fā)現,與陰性對照組小鼠相比,實驗組小鼠皮膚顏色提前24h由粉紅色變?yōu)楹谏?推遲24h由黑色變?yōu)榛疑?毛囊生長期時間較陰性對照組長近72h,表現與陽性對照組結果相似。提示EGCG與米諾地爾一致,可誘導毛囊進入生長期,延長生長期時間,并推遲進入退行期。我們還發(fā)現,實驗第4天時,切取每組小鼠背部皮膚,觀察到實驗組和陽性對照組皮下血管網豐富,血管較粗;而基質組和陰性對照組未見此現象。推測EGCG和米諾地爾一樣具有促進血管增生的作用。同時在實驗第20天,我們觀察到實驗組、陽性對照組與陰性對照組小鼠毛囊數目,在統(tǒng)計學上均具有極顯著性差異,P<0.001;基質組與陰性對照組相比無顯著性差異,P>0.05;實驗組與陽性對照組相比較無顯著性差異,P>0.05。由此可見EGCG具有促進毛囊生長的作用,且此作用與米諾地爾相當。本研究結果顯示EGCG可誘導C57BL6毛囊進入生長期,延長生長期時間,并推遲進入退行期,具有促進毛囊生長的作用,可能與其促進血管增生作用有關。國內外均有研究發(fā)現EGCG可促進人毛發(fā)及體外培養(yǎng)的毛囊生長和體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞增殖。但人與動物有著種屬差異,故EGCG促進毛發(fā)生長作用的機制有待進一步的研究。EGCG購于美國Sigma公司,貨號E4143;5%米諾地爾溶液(商品名:蔓迪)。局部皮膚直接用棉簽涂抹給藥,每天定時給藥1次,每次給藥量為0.1ml,連續(xù)給藥20天。采用SPSS.11統(tǒng)計軟件進行兩樣本均數的t檢驗。2.2皮膚he染色觀察2.2.1實驗第4天時,切取每組小鼠背部皮膚,可觀察到實驗組和陽性對照組皮下血管網豐富,血管較粗;而基質組和陰性對照組未見此現象,見圖1。