馬鹿精神分類與受胎性能研究

馬鹿精神分類與受胎性能研究

馬鹿是二級國家保護動物，生產(chǎn)鞭毛高、經(jīng)濟價值高、人工飼料越來越受歡迎。鹿茸是生產(chǎn)醫(yī)藥和保健品的珍貴材料,養(yǎng)鹿的主要目的就是為了獲取鹿茸,但只有雄性馬鹿才長鹿茸,因此利用現(xiàn)代生物技術(shù)人為控制馬鹿后代的性別,能夠明顯提高馬鹿養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益。性別控制技術(shù)是指人為干預動物的正常生殖活動,使動物能夠按照人們的意愿繁衍所需性別后代的一種繁殖技術(shù),具有巨大的利用價值。自Johnson(1989)首先報道用流式細胞儀分離兔X和Y精子,并使用分離精子受精后產(chǎn)下后代以來,精子分離/性別控制技術(shù)已經(jīng)在多種哺乳動物上取得成功,尤其是在奶牛繁育領域已得到商業(yè)化推廣應用。目前,國內(nèi)外對馬鹿性控技術(shù)的研究較少,僅有新疆塔里木大學高慶華等(2007)報道成功分選了馬鹿X/Y精子,但沒有產(chǎn)出后代。本試驗對馬鹿鮮精長距離運輸保存條件、馬鹿X/Y精子分離以及性控凍精人工授精條件等進行研究,為該技術(shù)大規(guī)模推廣應用積累技術(shù)基礎。1材料和方法1.1材料表面1.1.1t保護劑/最佳外包lactTALP染色液:40mmol/LHepes,0.4mmol/LMgCl2,95mmol/LNaCl,3mmol/LKCl,0.3mmol/LNa2HPO3,2mmol/LNaPyruvate,5mmol/LGlucose,25mmol/LNaLactate,0.3%BSA;分離鞘液(sheath液):197nMTris-堿+55.4mM檸檬酸+47.5mM果糖;TCF冷凍液:200mmol/LTris+65mmol/L檸檬酸+56mmol/L果糖;TrisA:(TCF+20%卵黃);TrisB:(TCF+20%卵黃+12%甘油);熒光染料:Hoechst33342(5mg/mL)(Sigma,StLouis,USA);三聯(lián)抗生素:Tylosin(19.0mg/mL)∶Gentamicin(99.01mg/mL)∶Lincomycin-Spectinomycin=3∶4∶3。1.1.2公鹿常用的皮膚組織藥物選取內(nèi)蒙古健元鹿業(yè)頂級種公鹿鉆石3#,用鹿眠寶麻醉,藥量0.012mL/kg。待公鹿完全麻醉后,用清水清洗公鹿陰莖包皮內(nèi)部及周圍皮膚組織,再用生理鹽水清洗2次,以防水進入精液。用電刺激法采精,電壓不超過12V。采精完畢后,用鹿醒寶復蘇。采集后的鮮精立即添加適量的三聯(lián)抗生素,放入18℃水浴保溫桶中,立即運至實驗室。1.2方法1.2.1熒光染料的制備用50μm的濾器過濾,并用TALP染色液稀釋。目測活力,檢測密度,然后保存于18℃冰箱中待用。在室溫下,取2億馬鹿精子,360g離心5min,吸棄上清液,用TALP稀釋液稀釋成200×106/mL,按順序向4mL的上機管中加入12μLhochest33342熒光染料(5mg/mL)和稀釋后的精液,搖勻,樣品在34℃水浴中孵育,每隔15min搖晃1次,保證精子染色的一致性。經(jīng)45min的水浴孵育后,加入同溫度同體積的Foodcoloring染液(含有4%卵黃(v/v)和0.002%(v/v)的食物染料),染色精子的最終濃度為1×108/mL,在樣品分離前再用50μm的濾器過濾1次。1.2.2精子分離條件過濾后的染色精子用流式細胞儀(MoFlo-SX;DakoCytomationUSA)進行X/Y分離,分離鞘液的壓力控制在30psi,激光照射的強度為150mW下運行,分離門設定為90%,R2選取X精子區(qū)域,R3選取Y精子區(qū)域。為保證Y精子的純度,R3不超過40%,且分離過程中調(diào)整DDampl、Phase保持drop形狀,保證最后一滴含精子振流水滴處在標記位置。1.2.3冷凍液和精細管的灌裝參考牛性控凍精生產(chǎn)流程,馬鹿性控凍精裝精量200萬～220萬/劑,冷凍液采用TrisA/B冷凍液。用法國卡蘇公司單頭精液灌裝機灌裝精液,采用0.25mL的塑料凍精細管。初凍溫度-70℃至-80℃,液氮罐上的溫度計刻度從-90℃下降到-120℃時,將精液直接投入液氮保存。1.2.4分離液的制備取5mL上機管,先加20μL熒光染料,再加1mLsheath8.0(pH調(diào)整為8.0的分離鞘液),最后將解凍后的分離精液加入管內(nèi),精液體積不低于20μL。上下顛倒搖晃幾次(注意動作要輕),使精液與染料混勻,放入34°C水浴鍋溫育20min。溫育完成后,用超聲波處理分離后精子(脈沖設為6,時間1s),用調(diào)整好的moflo分離機以約100事件/s的速度進行再分離,處理至少5000個事件,根據(jù)軟件要求計算出分離樣品X或Y精子的準確度。1.2.5在離心管的制備將裝有分離精子的凍精細管從液氮中取出,直接投入37℃水浴中,10s后取出放入1.5mL離心管中,在37℃水浴鍋中保存。參照牛冷凍精液標準檢測活力及存活時間。1.2.6人工授精處理本研究使用的全部為自然發(fā)情的母鹿,在發(fā)情后12h到24h內(nèi)進行人工授精處理。馬鹿野性較大,膽小易驚,為保障人畜安全,提高工作效率,人工輸精前注射鹿眠寶進行麻醉,子宮角深部輸精完成后,注射鹿醒寶復蘇。2結(jié)果2.1不同采精溫度、運輸時間、保溫桶時間對精子活率的影響本研究中,種馬鹿精液運輸保溫桶水浴溫度均調(diào)至18℃,在表1中,第1、2次采精,溫度保持較好,精子活率也較好;第3次采精運輸時間較長,保溫桶由于靠近汽車暖氣,溫度明顯上升,活率大幅下降。由此可見,運輸溫度及運輸時間對原精活率影響較大,運輸溫度控制在18～20℃,運輸時間越短越好。2.2第3次分離速度與2次運行時死精率結(jié)果對比本試驗對同一種公鹿不同死精率精子的分離效果進行比較,結(jié)果見表2。第1次及第2次的死精率差異不顯著(P>0.05),且遠低于第3次(P<0.05),第3次分離速度與1、2次差異顯著(P<0.05),表現(xiàn)為死精率越低,分離速度越高,分離效果越好。3次試驗的分離準確率沒有顯著差異(P>0.05,表2)。2.3兩組精子活力比較表3顯示了鮮精死精率與分離并冷凍后的精子活力與存活時間的關(guān)系。第1次及第2次的死精率差異不顯著(P>0.05),但與第3次差異顯著(P<0.05)。不論哪組樣品,解凍后4h精子活力均明顯下降(P<0.05),但各組之間的差異不明顯(P>0.05)。表3數(shù)據(jù)顯示分離精子解凍后活力與鮮精的的死精率并沒有相關(guān)性,可能是因為分離選擇活精子的原因,而凍融后活力更多地取決于冷凍、解凍處理及條件,而與鮮精的活力相關(guān)性小。2.4角深部輸精后注射鹿神寶本試驗中,所有母馬鹿均為自然發(fā)情。人工輸精前,注射鹿眠寶麻醉,子宮角深部輸精完成后,注射鹿醒寶復蘇。表4數(shù)據(jù)顯示性控凍精的情期受胎率67.5%(54/80),性控準確率達到100%(54/54),與普通凍精情期受胎率相比無顯著差異,但公犢率差異顯著(P<0.05)。3溫度和時間對馬鹿精子分離效率的影響由于馬鹿養(yǎng)殖場與精子分離試驗室距離較遠,運輸時間至少4h以上,加上流式細胞儀分離速度的限制,分離1頭公鹿射精量的精液需要相當長的時間。以內(nèi)蒙古蒙牛繁育生物技術(shù)有限公司精子分離實驗室目前較快的分離速度6000個/s,分離每個含1億精子的染色樣本約需要1h,那么,分離完1個精子總量30億的精液樣本需要30h,因此,精液的保存尤為重要。本試驗借鑒奶牛精液的保存條件,即新鮮精液添加適量的三聯(lián)抗生素(CSS),18℃恒溫保存。試驗共采精3次,第1、2次采精運輸時間2h,到達實驗室溫度均為19℃,鮮精目測活率(80%vs85%)差異不顯著(P>0.05),第3次采精運輸時間4h,且溫度控制不好,到達時溫度28℃,活率僅50%,與1、2次差異顯著(P<0.05),由此可見,溫度控制直接影響鮮精活率。本試驗結(jié)果表明,奶牛鮮精的保存方法同樣適用于馬鹿鮮精,且效果比較理想。影響精子分離速度的因素很多,流式細胞儀自身的硬件設施、調(diào)試狀態(tài)、鞘液壓力、精液品質(zhì)、染色效果等。本試驗在其他條件基本一致的前提下,重點探討了精液品質(zhì)對分離效果的影響。由試驗數(shù)據(jù)可明顯看出,精液品質(zhì)越好,死精率越低,分離效果越好,分離速度越快;反之,則越慢。而分離準確率差異不明顯,與精液品質(zhì)關(guān)系不大。這是因為分離準確率更多地取決于分離時所取區(qū)域的百分比、dropdelay的穩(wěn)定性以及噴嘴壓力。表3數(shù)據(jù)顯示了雖然分離前精液活力差異顯著,但分離后精子活力與4h活力差異不顯著。這可能與流式細胞儀分離機制有關(guān)。精液經(jīng)過Hoechst33342染色后,再用含5%的食品紅(FD&C40#)染液染色,這種色素只能滲入膜已經(jīng)受損的死精子并著上紅色,將原本精子上Hoechst33342的熒光信號部分掩蓋,進而導致激發(fā)光強度降低而顯示為獨立的精子群,分離時用計算機軟件控制直接拋棄,這樣既可提高分離效率,還可提高分離后精子活力。但從分離效率及受胎率考慮,應該盡可能選用品質(zhì)好的精液進行分離。本試驗中出現(xiàn)1次分離后精子解凍后出現(xiàn)抱團現(xiàn)象,可能與冷凍液有關(guān),因馬鹿精子分離相關(guān)的研究較少,本次試驗基本采用奶牛性控凍精的冷凍液及冷凍流程,因此,有必要進一步研究適用于馬鹿精子的冷凍液及冷凍流程。許多研究表明流式