柑桔潰瘍病拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

柑桔潰瘍病拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

柑橘潰瘍是由地中海草黃單胞菌的小麥菌引起的。目前，對該病的病因、發(fā)生規(guī)律、化學(xué)防治等方面的研究取得了一些進(jìn)展。國外有人對該病進(jìn)行了預(yù)防性研究，但中國很少有這方面的報告。作者在柑橘潰瘍區(qū)的多個品種的柑橘葉片和幼果中進(jìn)行了微生物分離、室內(nèi)篩選、溫室和田地效應(yīng)的抗逆性試驗(yàn)，篩選有效的抗逆性，為柑橘潰瘍找到有效的防治和抗病性提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1病例對照調(diào)查1999年從湖南衡山農(nóng)科所采集具有潰瘍病斑的新鮮甜橙病葉,香柚、甜橙、臍橙、紅橙春梢健康葉片;江永縣農(nóng)科所采集的香柚、夏橙、蜜桔夏梢健康葉片及幼果;南岳園藝場采集的香柚、臍橙、夏橙、蜜桔春、夏梢健康葉片及幼果.1.2k-2和k-18菌的抗菌藥活性測定1)病原菌的分離與拮抗菌株的篩選.采用平板稀釋分離法分離有病斑的新鮮甜橙病葉的病原菌.健康春、夏梢柑桔葉片與幼果表面拮抗微生物菌株的分離方法為:每支試管裝1片葉或1個幼果,加入4mL滅菌水,搖動10min.然后每管各取1mL含菌水溶液進(jìn)行平板稀釋分離,用分離到的菌株進(jìn)行柑桔潰瘍病菌平板拮抗測定,篩選出具有拮抗作用的菌株.2)拮抗菌株生物學(xué)特性初步測定.28℃在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h,觀察菌落形狀及革蘭氏染色結(jié)果.3)拮抗菌株生長的最適pH值測定.K-2,K-18在pH值分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中,30℃80r/min振蕩培養(yǎng)48h,用721型分光光度計(jì)測定培養(yǎng)液在波長為620nm處的吸光值.設(shè)3次重復(fù),結(jié)果取平均值.4)K-2,K-18的無菌濾液對柑桔潰瘍病菌的拮抗效果測定.用孔徑為25nm的細(xì)菌過濾器過濾已培養(yǎng)24h的K-2,K-18新鮮懸浮液,以無菌水為對照,用無菌過濾液平板拮抗測定柑桔潰瘍病菌,28℃下培養(yǎng)24h,測量抑菌圈直徑.5)K-18的抗生素成分初步測定.對K-18的無菌濾液分別進(jìn)行水合茚三酮反應(yīng)和α-萘酚試驗(yàn),測定是否含有蛋白多肽類物質(zhì)或糖類物質(zhì).6)防效試驗(yàn).1999年4月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植病研究室進(jìn)行溫室防效試驗(yàn),4月13日噴霧接種,5月16日記錄各株甜橙的發(fā)病情況.將培養(yǎng)的新鮮潰瘍病菌懸浮液稀釋到菌體含量為1×109/mL,K-2,K-18懸浮液各自稀釋為3×108/mL.將有新梢的18株甜橙按新梢葉片分為3組,每組葉片數(shù)基本相等,設(shè)3個處理:Ⅰ.同時接種柑桔潰瘍病菌和K-2菌;Ⅱ.同時噴霧接種柑桔潰瘍病菌和K-18菌;Ⅲ.只接種柑桔潰瘍病菌,作為對照.接種后保濕5d.第25天調(diào)查記錄各葉的病斑數(shù),并進(jìn)行K-2,K-18菌的分離.計(jì)算各組葉片的發(fā)病率、病情指數(shù).1999年7月在湖南衡山縣園藝場進(jìn)行大田防效試驗(yàn).選取3株10年生甜橙樹,每株選取7枝位于不同方向的當(dāng)年生夏梢,將菌體含量為1×109/mL的柑桔潰瘍病菌懸浮液與菌體濃度均為3×108/mL的K-18,K-2懸浮液按以下方式對各個枝條進(jìn)行噴霧接種.A.同時噴施病原菌與K-18;B.先噴施病原菌,2d后再噴施K-18;C.先噴施K-18,2d后再噴施病原菌;D.同時噴施病原菌與K-2;E.先噴施病原菌,2d后再噴施K-2;F.先噴施K-2,2d后再噴施病原菌;G.只噴施病原菌,作為對照.第23天調(diào)查各葉的病斑數(shù),并進(jìn)行K-2,K-18菌的分離.計(jì)算各組葉片的發(fā)病率、病情指數(shù).7)柑桔潰瘍病病情分級標(biāo)準(zhǔn).0級,0個病斑;1級,1～5個病斑;2級,6～10個病斑;3級,11～20個病斑;4級,21個以上病斑.2結(jié)果與分析2.1兩組菌株對柑橘社會養(yǎng)菌圈的生長采用平板稀釋分離法分離具有潰瘍病斑的新鮮甜橙葉片,得到柑桔潰瘍病病菌Xanthomonasaxonopodispv.citri7個菌株.分離從衡山農(nóng)科所、南岳園藝場等地采回的材料,得到29個細(xì)菌菌株,6個真菌菌株,依次編號為K-1,K-2,……,K-35.用這些菌株進(jìn)行對柑桔潰瘍病菌的平板拮抗測定,發(fā)現(xiàn)K-2,K-18對柑桔潰瘍病菌具有拮抗作用,溶菌圈大小分別為18mm×19mm,51mm×52mm,其他菌株無拮抗效果.2.2菌體及細(xì)胞生長特性K-2,K-18的菌體細(xì)胞都為桿狀,單個,成雙或成鏈狀排列,極生鞭毛.K-2菌體細(xì)胞長1.3～2.4μm,寬0.4～0.6μm,革蘭氏染色陽性,菌落為圓形、扁平、表面皺折、邊緣不整齊、不透明、乳白色,菌落直徑1～2cm,5d后變?yōu)闇\黃色.K-18的菌體細(xì)胞長1.3～2.9μm,寬0.58～0.75μm,革蘭氏染色陰性,菌落為圓形、隆起、邊緣不整齊、有時呈假根狀、半透明、白色,表面光滑,有粘性.2.3最適生長ph值的測定由K-2,K-18的吸光值(圖1)可見,K-2,K-18菌分別在pH值為7.0,7.5時吸光值最大,表明K-2菌生長的最適pH值為7.0,K-18菌生長的最適pH值為7.5.2.4k-18菌對柑橘腐爛病原菌的溶菌圈采用平板測定方法,發(fā)現(xiàn)K-18的無菌濾液能對病原菌產(chǎn)生非常明顯的溶菌圈,處理48,72h后溶菌圈大小為32mm×31mm,34mm×33mm.而K-2無菌濾液產(chǎn)生的溶菌圈不很明顯,處理48,72h后溶菌圈大小為8mm×9mm,9mm×10mm.說明K-18菌能產(chǎn)生對柑桔潰瘍病菌具有較強(qiáng)溶菌效果的抗生物質(zhì).2.5氨基多肽和非芳烴-酚類物質(zhì)的表征K-18無菌濾液加入0.2%水合茚三酮溶液后在沸水中加熱5min,變?yōu)樽仙?為陽性,表明其中含有氨基多肽類物質(zhì).其α-萘酚試驗(yàn)結(jié)果為陰性,表明所產(chǎn)生的抗生類物質(zhì)為非糖類.2.6k-2和k-18對柑橘世界區(qū)域防治效果由溫室防治效果(表1)發(fā)現(xiàn),對照只接種潰瘍病菌的葉片發(fā)病率達(dá)76.1%,病情指數(shù)達(dá)30.7.同時分別噴施了K-2,K-18的葉片發(fā)病率分別降低65.9%,71.4%,病情指數(shù)分別減小28.2,29.5,并能從葉片上再次分離到這兩種細(xì)菌.說明K-2,K-18在溫室中對柑桔潰瘍病具有良好的防治效果.由表1可知,大田防效試驗(yàn)中,噴施了K-2,K-18的葉片發(fā)病率降低16.4%～31.6%,病情指數(shù)減小14.4～28.8,并能從葉片上再次分離到這兩種細(xì)菌.說明K-2,K-18在大田中對柑桔潰瘍病都具有較好的防治效果.不同處理的防治效果比較可知,K-18與病原菌同時接種時發(fā)病最輕,其原因可能是兩者同時大量存在于葉表時,K-18所產(chǎn)生的抗生物質(zhì)直接殺死了病原菌.先接種K-2菌,2d后再接種病原菌的一組發(fā)病率最低,病情指數(shù)也最小,可能是K-2在葉上具有較強(qiáng)的定殖能力,能占據(jù)葉表位點(diǎn),特別是氣孔的周圍,阻止病原菌的侵入.3k-18的不同對柑橘排他病的防治效果a.從分離結(jié)果看,柑桔葉表微生物種類繁多,有必要進(jìn)一步對柑桔葉、果表面微生物在不同生長季節(jié)的動態(tài)變化進(jìn)行研究,以發(fā)現(xiàn)這種變化與病害發(fā)生之間的相互關(guān)系.b.K-18產(chǎn)生的抗生素對柑桔潰瘍病病菌具有溶菌作用,其作用機(jī)制正在研究之中.c.K-2