好氧反硝化菌研究進(jìn)展

好氧反硝化菌研究進(jìn)展

隨著工業(yè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，自然界中氮素的平衡逐漸受到打破，這不僅造成了嚴(yán)重的污染和經(jīng)濟(jì)損失，而且還危及人類健康和生態(tài)安全。因此，國內(nèi)外研究人員分別發(fā)現(xiàn)了生物脫氮率高、穩(wěn)定等特點(diǎn)，并建立了傳統(tǒng)的生物硝化反硝化理論。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，生物脫硝反應(yīng)以兩種反應(yīng)相結(jié)合的速度完成，反應(yīng)后階段需要相應(yīng)的功能微生物和嚴(yán)格的環(huán)境條件：在好氧條件下，將氨氮轉(zhuǎn)化為硝氮和硝氮。然后，在缺乏或厭倦氧氣的條件下，異質(zhì)異族環(huán)胞將硝氮轉(zhuǎn)化為氣物質(zhì)產(chǎn)品。其中，研究人員普遍認(rèn)為，只有在缺乏和氧氣的條件下，抗硝化酶系統(tǒng)才有效，生物反硝化過程才能正常進(jìn)行。然而,1980年Meiberg等在HyphomicrobiumX氧化二甲胺/三甲胺過程發(fā)現(xiàn),該菌株在好氧條件下具有反硝化功能.隨后,Robertson等在廢水脫硫和反硝化系統(tǒng)中首次分離出一株好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha(現(xiàn)名脫氮副球菌Paracoccusdenitrificans),該菌株在利用氨氮過程中未出現(xiàn)明顯的亞硝氮積累,具有同步異養(yǎng)硝化與好氧反硝化功能.此后,陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道從不同環(huán)境樣品及廢水處理系統(tǒng)中分離篩選出大量具有好氧反硝化功能的微生物,為同步硝化反硝化生物脫氮新技術(shù)奠定了基礎(chǔ)[4~11].本文即綜述了國內(nèi)外已篩選分離的主要好氧反硝化菌類群及其生長特性,重點(diǎn)闡述了好氧反硝化的作用機(jī)理、影響因素以及其在環(huán)境生物修復(fù)中的應(yīng)用,并對(duì)今后的研究與應(yīng)用方向作了展望.1廢水脫硫廢水的預(yù)處理好氧反硝化菌(Aerobicdenitrifier)是一類在有氧條件下利用周質(zhì)硝酸鹽還原酶(Periplas??icnitratereductase)等好氧反硝化酶進(jìn)行脫氮反應(yīng)的異養(yǎng)微生物,其分布廣泛,可適應(yīng)多種生境,多為好氧或兼性好氧.迄今為止,已分離獲得大量具有好氧反硝化功能的菌株(表1),主要分屬副球菌屬(Paracoccus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)和芽孢桿菌屬(Bacillus)等.目前,研究報(bào)道較全面的菌種包括最早從廢水脫硫和反硝化處理系統(tǒng)分離獲得的T.pantotropha(P.denitrificans),從豬場(chǎng)養(yǎng)殖廢水分離獲得、可耐受92%高濃度氧分壓的PseudomonasstutzeriSU2[13~14],從處理豬場(chǎng)廢水活性污泥系統(tǒng)分離獲得的AlcaligenesfaecalisNo.4[15~17],以及從脫氮除磷活性污泥和環(huán)境樣品中均分離得到的Microvirgulaaerodenitrificans[18~19].2氧漂后氧化應(yīng)環(huán)境參數(shù)ld50與傳統(tǒng)的反硝化細(xì)菌相比,好氧反硝化菌具有以下生長特性:1)有氧生長,大多數(shù)菌種可耐受3mg/L以下的溶解氧,部分菌種在高氧氣分壓下也具有反硝化活性,少數(shù)可耐受5~6mg/L溶解氧濃度(表1);2)大多好氧反硝化菌同時(shí)具有異養(yǎng)硝化及代謝難降解有機(jī)物的能力;3)生長周期短,生長速率遠(yuǎn)大于自養(yǎng)菌,例如文獻(xiàn)報(bào)道Nitrosomonaseuropaea的最大比增長速率約為0.03~0.05h-1,而在同等生長條件下T.pantotropha的最大比生長速率高達(dá)0.4h-1,有效彌補(bǔ)了其異養(yǎng)脫氮活性相對(duì)較低的缺陷;4)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)(pH、DO等條件),對(duì)高濃度有機(jī)物和氮的耐受力強(qiáng);5)反硝化氣態(tài)產(chǎn)物一般為氧化亞氮(N2O),少數(shù)為氮?dú)?N2).3對(duì)氧分子的影響為更好地闡明好氧反硝化過程機(jī)理及強(qiáng)化其脫氮過程的關(guān)鍵因子,研究者分別從降解酶系統(tǒng)、電子呼吸鏈等角度對(duì)部分模式菌株進(jìn)行了功能研究.從兩種反硝化菌的酶系統(tǒng)考慮,研究者分析發(fā)現(xiàn)整個(gè)反硝化過程涉及到4種還原酶,分別為硝酸鹽還原酶(Nitratereductase,Nar)、亞硝酸鹽還原酶(Nitritereductase,Nir)、一氧化氮還原酶(Nitric--oxidereductase,Nor)和一氧化二氮還原酶(Nitrous--oxidereductase,Nos).相比厭氧反硝化菌,好氧反硝化菌的細(xì)胞內(nèi)存在不受溶解氧抑制的反硝化酶系統(tǒng)(圖1).研究表明菌株的好氧反硝化能力與其特殊硝酸鹽還原酶的表達(dá)密切相關(guān).硝酸鹽還原酶(Nar)具有兩種不同的形式:一種是膜結(jié)合硝酸鹽還原酶(Membrane-boundnitratereductase,M-Nar),它在厭氧環(huán)境優(yōu)先表達(dá),但對(duì)氧分子敏感,有氧條件下其活性易受抑制;另一種周質(zhì)硝酸鹽還原酶(Periplasmicnitratereductase,P-Nar)則具有較強(qiáng)的耐氧能力.從電子呼吸鏈角度來看,Robertson等研究認(rèn)為厭氧反硝化時(shí)電子在向氧原子傳遞的過程中存在“瓶頸”(圖1),而在好氧反硝化過程電子可在細(xì)胞色素c(Cytc)和細(xì)胞色素aa3(Cytaa3)傳遞從而解除氧氣對(duì)反硝化電子呼吸鏈途徑的抑制,使得過剩的還原力通過周質(zhì)硝酸鹽還原酶傳遞給硝酸鹽(NO3-),將其還原為亞硝酸鹽(NO2-).此外,T.pantotropha可誘導(dǎo)或使用額外的細(xì)胞色素,則電子同時(shí)在多條細(xì)胞色素支鏈流動(dòng),從而打破“瓶頸”,使其可在不同底物條件下生長增殖.Kong等提出好氧反硝化菌中可能存在一種能以醌氫類(QH2)為電子供體、不受氧分子抑制的硝酸鹽還原酶(Oxygenresistednitratereduetase,orNar),以及一種以細(xì)胞色素bc1(Cytbc1)為電子供體且不受氧分子抑制的亞硝酸鹽還原酶(Oxygenresistednitritereductase,orNir),從而在有氧條件下可將醌類的電子傳遞給硝酸鹽分子將其還原,同時(shí)接受Cytbc1的電子生成NOx完成整個(gè)呼吸過程.此外,Chen等從電子分配角度研究了Pseudomonasaeruginosa好氧反硝化過程電子受體——氧和硝酸根的競爭影響,發(fā)現(xiàn)反硝化過程接收每個(gè)電子的能量得率是氧氣呼吸途徑的69%.只有在較低溶解氧條件下(<0.05mg/L),增大溶解氧方能促進(jìn)有氧呼吸,溶解氧的增大只微弱增強(qiáng)其對(duì)反硝化的抑制,厭氧時(shí)菌株的表觀細(xì)胞得率明顯減小,缺少NO3-或O2都會(huì)降低其生長率和反硝化率.可見,好氧反硝化菌包含兩種硝酸鹽還原酶,反硝化和有氧呼吸系統(tǒng)并存,NO3-和O2同時(shí)被還原,反硝化作用則可能以電子受體的角色與有氧呼吸形成輔助或競爭關(guān)系.明晰了好氧反硝化過程途徑及機(jī)理,有助于我們從酶系統(tǒng)、電子呼吸鏈及基因角度,優(yōu)化獲得更高效的好氧反硝化菌篩選方法.現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的好氧反硝化菌的篩選方法主要有施加一定選擇壓(如間歇曝氣)或采用選擇性培養(yǎng)基馴化富集,而高效的菌種篩選方法是微生物強(qiáng)化技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵.Carter等依據(jù)周質(zhì)及膜結(jié)合硝酸鹽還原酶生化特性的嚴(yán)格區(qū)別,利用還原性甲級(jí)紫精(MV+)和還原性苯甲基紫精(BV+)分別作為電子供體,以區(qū)分周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中硝酸鹽還原酶的活性位點(diǎn),采用此種方法在4種環(huán)境樣品中篩選到多種好氧反硝化功能微生物.孔慶鑫等利用氰化鉀(KCN)作為呼吸抑制劑,終止呼吸鏈中電子由細(xì)胞色素aa3(Cytaa3)向氧的傳遞,從而抑制氧作為電子受體的呼吸反應(yīng),同時(shí)結(jié)合曝氣狀態(tài)下氧分子對(duì)相關(guān)酶的表達(dá)或活性的抑制,使好氧反硝化菌更易被選擇性篩選.4羥胺氧化酶hao,no好氧反硝化系統(tǒng)的存在,使得反硝化菌與硝化菌能夠同時(shí)生長于好氧環(huán)境,在單一構(gòu)筑物內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化,大大節(jié)省了工程投資,并在系統(tǒng)堿度維持等方面更具經(jīng)濟(jì)性.不僅如此,陸續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)某些好氧反硝化菌同時(shí)具有異養(yǎng)硝化功能,即在有機(jī)物存在下通過不同酶系的協(xié)同作用完成硝化與反硝化兩個(gè)過程,將氨氮直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物去除(圖2),單一微生物即可完成脫氮過程.Richardson等研究認(rèn)為同步異養(yǎng)硝化–好氧反硝化的脫氮機(jī)理為:在好氧環(huán)境下,菌體利用氨單加氧酶(AMO)將氨氮氧化為羥胺,進(jìn)而在異養(yǎng)硝化菌特有的不含血紅素的羥胺氧化酶(HAO)作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽或N2O;同時(shí),體系中的硝酸鹽在周質(zhì)硝酸鹽還原酶(NAP)等的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁},最終轉(zhuǎn)化為N2O或N2脫除[40~42].但這并不是此類細(xì)菌同步異養(yǎng)脫氮的唯一途徑.對(duì)Alcaligenesfaecalisno.4的研究發(fā)現(xiàn),只有很少的氨氮轉(zhuǎn)化成亞硝氮,主要的反硝化是通過氨氧化而成的羥胺脫除,反應(yīng)終產(chǎn)物90%為氮?dú)?N2).分離得到的Acinetobactersp.YY-5并不能發(fā)生好氧反硝化,但能在3d內(nèi)將氨氮由95.23mg/L降解至1.29mg/L,降解率達(dá)到98.6%,同時(shí)未發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮積累,其主要代謝氣體產(chǎn)物為CO2和N2,無N2O生成.最近報(bào)道的異養(yǎng)硝化菌AcinetobactercalcoaceticusHNR在整個(gè)脫氮過程中并無亞硝酸鹽及硝酸鹽的產(chǎn)生,該菌株不能利用硝酸鹽及亞硝酸鹽,系統(tǒng)內(nèi)檢測(cè)不到硝酸鹽還原酶(Nar)和亞硝酸鹽還原酶(Nir),氨單加氧酶(AMO)、羥胺氧化酶(HAO)在該類菌種利用羥胺直接脫除氨氮的過程中可能發(fā)揮重要作用.此外,菌株Alcaligenesfaecalisno.4在不同培養(yǎng)條件下均有約40%~50%的氨氮去除率,其中至少一半轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的氮儲(chǔ)存.Kim等發(fā)現(xiàn)PseudomonasputidaAD-21的培養(yǎng)體系中氨氮主要同化為谷氨酸鹽被菌體吸收,而硝氮進(jìn)行反硝化脫除.這些研究表明氨氮主要作為氮源供菌體生長,硝酸鹽進(jìn)行反硝化,同時(shí)氨氮的存在能促進(jìn)細(xì)胞生長和反硝化生成N2,防止N2O的積累.5影響生物反應(yīng)速率的因素在廢水生物處理系統(tǒng)中,溶解氧(Dissolvedoxygen,DO)、碳氮比(C/N)、溫度和pH是影響生物反應(yīng)速率的主要因素,如系統(tǒng)DO水平直接影響反硝化有氧呼吸,進(jìn)水碳氮比(C/N)則關(guān)系到碳源利用效率和細(xì)胞生長.5.1好氧反硝化菌的篩選如前所述,反硝化過程涉及到4種反硝化酶,其合成和活性均受溶解氧的控制,其中硝酸鹽還原酶的耐氧能力最強(qiáng),而N2O和/或NO的生成幾乎可被溶解氧完全抑制,研究證實(shí)一氧化二氮還原酶(Nos)的溶解氧抑制濃度低于0.2mg/L,硝酸鹽還原酶在DO高于4mg/L時(shí)受到抑制.因此,DO濃度影響反應(yīng)終產(chǎn)物的生成.低溶氧條件下,硝酸鹽還原酶的活性較低,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長率和反硝化率降低,硝酸鹽還原酶則處于休眠狀態(tài),但有利于N2生成.高溶解氧條件下,聚-β-羥基丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)得以積累利于快速脫氮,較易發(fā)生同步硝化反硝化(SND).但也有研究者認(rèn)為好氧反硝化作用的啟動(dòng)并不依賴于相關(guān)酶系對(duì)氧氣的敏感程度,而是與調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的氧氣或氧化還原的敏感因子有關(guān).通常篩選分離到的好氧反硝化菌具有一定的溶解氧閾值,當(dāng)DO濃度高于該值時(shí)對(duì)該菌種的反硝化效果有抑制作用.如表1所示,大多數(shù)好氧反硝化菌可耐受3mg/L以下的溶解氧,部分菌種在高氧氣分壓下仍具有反硝化活性,可耐受5~6mg/L溶解氧[20~21].對(duì)Pseudomonassp.C3的研究表明,溶解氧對(duì)反硝化基本沒有抑制作用,在DO為2.3~11.3mg/L范圍內(nèi),該菌株都可以選擇硝酸鹽作電子受體.上述好氧菌株的發(fā)現(xiàn)更利于好氧反硝化優(yōu)勢(shì)的體現(xiàn).同時(shí)研究表明,多數(shù)好氧反硝化細(xì)菌屬兼性細(xì)菌,可同時(shí)表達(dá)周質(zhì)及膜結(jié)合硝酸鹽還原酶活性,因此周期性好氧/厭氧環(huán)境交替有利于其富集成為優(yōu)勢(shì)菌.Patureau等研究發(fā)現(xiàn)施加一定的選擇壓(間歇曝氣)進(jìn)行馴化,好氧反硝化菌可得到有效富集.對(duì)溶解氧轉(zhuǎn)變的適應(yīng)性使其能更好應(yīng)用于溶解氧波動(dòng)的情況下,消除過剩還原性物質(zhì).好氧菌株反硝化相關(guān)酶系的永久表達(dá)避免了普通反硝化菌在一段缺氧后重新誘導(dǎo),對(duì)曝氣條件變化能快速適應(yīng),具有很好應(yīng)用潛力.5.2碳源對(duì)好氧反硝化菌活性的影響有機(jī)碳源在整個(gè)脫氮過程中發(fā)揮重要作用.研究表明,好氧反硝化菌可利用碳源范圍較廣,包括某些難降解有機(jī)物.在對(duì)有限資源進(jìn)行競爭時(shí),混合營養(yǎng)(Mixotrophy)是決定菌種能否在競爭中取勝的重要因子,代謝的靈活性和反應(yīng)性在物種競爭中也占有重要作用.因此,可利用基質(zhì)的多樣性使得好氧反硝化菌在系統(tǒng)中具備一定競爭優(yōu)勢(shì).有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中,研究C/N對(duì)好氧反硝化菌影響的范圍較廣,在2~24之間(表1).有研究表明C/N在2~12之間,C/N越大則反硝化效果越好.分析其原因,高C/N能夠保證充足的碳源使反硝化作用更徹底,同時(shí)周質(zhì)硝酸鹽還原酶的基因調(diào)控蛋白FNR對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感,相對(duì)較高的C/N激活了好氧反硝化菌相關(guān)反硝化基因的表達(dá).而低C/N時(shí),碳源快速消耗,會(huì)造成硝化與反硝化之間的不均衡.另有部分研究結(jié)果顯示,對(duì)特定菌株,在較小范圍內(nèi)即存在最佳C/N值,此時(shí)的碳源濃度剛好能誘導(dǎo)足夠反硝化酶,繼續(xù)增加碳源其反硝化活性不會(huì)繼續(xù)增大.如Huang等認(rèn)為在1~7范圍內(nèi),C/N值為5是Citrobacterdiversus的最適碳氮比,高C/N下總體氮去除率增加但大多用于菌體合成而被消耗.Bernat等研究證實(shí)在好氧條件下的活性污泥可利用細(xì)胞內(nèi)PHB做唯一碳源進(jìn)行反硝化,外加乙酸鹽作為碳源時(shí),其好氧反硝化活性得到明顯提升.對(duì)細(xì)胞內(nèi)碳源的有效利用,為低碳氮比廢水的有效處理也提供了一條新的途徑.研究篩選適宜低C/N的好氧反硝化菌種,可針對(duì)特定水質(zhì)發(fā)揮其應(yīng)用優(yōu)勢(shì).5.3ph和溫度對(duì)發(fā)酵及風(fēng)味的影響對(duì)Pseudomonassp.C3的好氧反硝化性能的研究發(fā)現(xiàn),pH值對(duì)其反硝化能力影響顯著.不同pH值下,反硝化效能不同.在中性及偏堿(pH7~9)的條件菌株C3有較好的反硝化效果(脫氮率59%~93%),但在酸性(pH≤6)和強(qiáng)堿性(pH≥10)的條件下,菌株生長狀況差,對(duì)硝酸鹽基本沒有多少去除.研究表明pH對(duì)土壤中ParacoccusdenitrificansNOx還原酶基因的表達(dá)及反硝化作用模式有較大影響,在pH6~7.5的范圍內(nèi),次佳pH條件會(huì)抑制N2O的還原,抑制發(fā)生在相關(guān)蛋白的合成/裝配而非轉(zhuǎn)運(yùn)過程.溫度對(duì)菌株P(guān)seudomonassp.C3的反硝化效率的影響并不顯著,在25~35℃的溫度范圍內(nèi),該菌株都具有很高的脫氮效率.對(duì)菌株P(guān)seudomonaschloritidismutanX31的研究結(jié)果類似.相對(duì)較寬的pH和溫度范圍有利于好氧反硝化菌在環(huán)境中的競爭與存活,發(fā)揮其反硝化能力.此外,某些金屬離子(如二價(jià)鐵離子Fe2+)的加入可顯著提高菌體對(duì)NH4+和NO3-的利用效率.Kim等的研究也表明Ca2+、Fe2+和Mg2+等金屬離子子對(duì)Bacillussp.的生長和脫氮效率有較大影響.6好氧反硝化菌在環(huán)境生物修復(fù)系統(tǒng)中的應(yīng)用作為生物脫氮新技術(shù)之一的好氧反硝化,其與傳統(tǒng)的細(xì)菌厭氧反硝化相比具有如下優(yōu)勢(shì):好氧反硝化菌生長速度快、產(chǎn)量高,大多具有同步異養(yǎng)硝化性能,可在同一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)完成脫氮過程,大大減少了堿度投加量及構(gòu)筑物占地面積,具有較好的經(jīng)濟(jì)性.同時(shí),多數(shù)好氧反硝化菌適應(yīng)性較強(qiáng),對(duì)DO濃度要求較低,反硝化速度快且徹底,在環(huán)境生物修復(fù)系統(tǒng)運(yùn)行中更容易被調(diào)控.相比而言,傳統(tǒng)自養(yǎng)硝化細(xì)菌生長率低,普通反硝化菌對(duì)環(huán)境因素變化敏感,維持足夠菌體數(shù)量較難.目前,好氧反硝化菌主要應(yīng)用于廢水生物處理、養(yǎng)殖水體凈化等領(lǐng)域.6.1好氧反硝化菌群Pai等將篩選到的好氧反硝化菌種與活性污泥混合后處理污水,取得了很好的強(qiáng)化效果.Bouchez等采用海藻酸包埋技術(shù)成功將Microvirgulaaerodenitrificans接種于連續(xù)流反應(yīng)器(CSTR)進(jìn)行城鎮(zhèn)污水處理,菌體可在反應(yīng)絮體中有效持留.Gupta等采用T.pantotropha強(qiáng)化的三階旋轉(zhuǎn)生物接觸器(Roottaattiinnggbbiioollooggiiccaallcontactor,RBC)處理受高硝氮受污染地下水,該系統(tǒng)無需單獨(dú)碳氧化調(diào)控來強(qiáng)化硝化反硝化效果,反硝化過程的堿度補(bǔ)償經(jīng)濟(jì)性大幅提升.馬放等利用好氧反硝化菌群強(qiáng)化生物陶粒反應(yīng)器處理高濃度含硝氮廢水,系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后硝氮平均去除率可達(dá)93%以上,COD的平均去除率穩(wěn)定在98%,變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析發(fā)現(xiàn)好氧反硝化菌在整個(gè)運(yùn)行階段穩(wěn)定存在.Patureau等將Microvirgulaaerodenitrificans用于除磷系統(tǒng)強(qiáng)化,并對(duì)投加策略與菌體持留進(jìn)行了研究,結(jié)果表明初始碳源的添加與菌體加入量的控制起了關(guān)鍵作用.Barak等研究了有氧條件下Pseudomonasdenitrificans細(xì)胞內(nèi)聚磷酸鹽(Poly