乳酸的功能、類(lèi)型及應(yīng)用

乳酸的功能、類(lèi)型及應(yīng)用

硫酸，學(xué)名為-烷基丙烯酸，可根據(jù)其旋轉(zhuǎn)光度分為三種類(lèi)型。D型、L型和DL型3種。乳酸是一種重要的有機(jī)酸,廣泛存在于人體、動(dòng)植物及微生物中。乳酸、乳酸鹽及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、釀造、紡織等領(lǐng)域。由于人體只含有L-乳酸脫氫酶,所以只能夠分解自身產(chǎn)生或攝入的L-乳酸。從保健角度看,乳酸的構(gòu)型是相當(dāng)重要的,若過(guò)量食用D-乳酸或DL-乳酸會(huì)導(dǎo)致血液中富含D-乳酸,尿中會(huì)出現(xiàn)高酸度現(xiàn)象,引起代謝紊亂。世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)中使用L-乳酸取代目前普遍使用的DL-乳酸,因此研究大量生產(chǎn)L-乳酸代替D-乳酸和DL-乳酸成為一種趨勢(shì)。此外,L-乳酸還有正在大力開(kāi)拓的應(yīng)用領(lǐng)域,即生產(chǎn)聚L-乳酸。聚L-乳酸作為無(wú)毒、可降解的生物相容性高分子材料,可用來(lái)制造生物可降解塑料、綠色包裝材料和藥用修復(fù)材料等,以解決日益嚴(yán)重的“白色污染”問(wèn)題,已引起了世界的廣泛關(guān)注,應(yīng)用前景非常廣闊,具有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。隨著L-乳酸用途越來(lái)越廣泛,市場(chǎng)的需求量也越來(lái)越大。國(guó)內(nèi)外都已經(jīng)展開(kāi)了對(duì)其生產(chǎn)的深入研究,并取得了可喜的成果。1乳酸發(fā)酵過(guò)程原理及最佳發(fā)酵工藝由化學(xué)合成法生產(chǎn)乳酸可通過(guò)多種途徑,最常見(jiàn)的是乳腈法。該法是乙醛與氫氰酸經(jīng)堿性催化作用生成粗乳腈。粗乳腈通過(guò)蒸餾回收純化并用濃鹽酸或硫酸水解為粗乳酸和其他氨基酸副產(chǎn)物。粗乳酸的精制是先用甲醇酯化乳酸得到乳酸甲酯,蒸餾后再進(jìn)行水解生成乳酸與甲醇,甲醇可再循環(huán)利用。1.2酶法1.2.1氯丙酸酶法轉(zhuǎn)化日本東京大學(xué)的本崎等研究了用酶法催化合成乳酸,分別從惡臭甲單孢菌和假單孢菌的細(xì)胞中提取純化了L-2-鹵代酸脫鹵酶和DL-2-鹵代酸脫鹵酶,作用于底物DL-2-氯丙酸,制得L-乳酸或D-乳酸。L-2-鹵代酸脫鹵酶催化L-2-鹵代酸脫鹵;而DL-2-鹵代酸脫鹵酶既可催化L-2-鹵代酸脫鹵,又可催化D-2-鹵代酸脫鹵,在催化時(shí)可發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變。1.2.2丙酮酸酶法轉(zhuǎn)化Hummel等從D-乳酸脫氫酶活力最高的混亂乳桿菌DSM20196菌體中得到D-乳酸脫氫酶,以無(wú)旋光性的丙酮酸為底物得到D-乳酸。1.3發(fā)酵法發(fā)酵法制備乳酸是以還原糖、牛乳等為原料,接種微生物經(jīng)發(fā)酵而生產(chǎn)乳酸。乳酸菌一般不能直接利用淀粉質(zhì)原料,或先經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為還原糖后由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸,或加入糖化酶進(jìn)行邊糖化、邊發(fā)酵乳酸的“雙邊發(fā)酵”。其他的微生物,如根霉等,可直接利用淀粉、糊精等碳水化合物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。按發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物生成情況,可以將乳酸發(fā)酵分為以下四個(gè)類(lèi)型,它們各自具有不同的發(fā)酵機(jī)理。1.3.1同型乳酸發(fā)酵微生物通過(guò)EMP代謝途徑進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵,乳酸是代謝的惟一產(chǎn)物。1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸,理論轉(zhuǎn)換率為100%。但由于發(fā)酵過(guò)程中微生物有其他生理活動(dòng)存在,實(shí)際轉(zhuǎn)化率一般在80%以上者,即視為同型乳酸發(fā)酵,總反應(yīng)式為:C6H12O6+2ADP+2Pi→2C6Η12Ο6+2ADΡ+2Ρi→2CH3CHCOOH+2ATP1.3.2異型乳酸發(fā)酵微生物經(jīng)由Bifidus途徑和PK途徑生成等摩爾數(shù)的乳酸、CO2和乙醇。葡萄糖的轉(zhuǎn)化率只有50%,總反應(yīng)式為:C6H12O6+ADP+Pi→CH3C6Η12Ο6+ADΡ+Ρi→CΗ3CHCOOH+CH3CH2OH+CO2+ATP1.3.3雙歧發(fā)酵在該途徑中,2mol葡萄糖產(chǎn)生3mol乙酸和2mol乳酸,乳酸的轉(zhuǎn)化率為50%?？偡磻?yīng)式為:2C6H12O6→22C6Η12Ο6→2CH3CHCOOH+3CH3COOH1.3.4混合酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵在特殊情況下,如葡萄糖濃度受到限制、pH升高或溫度降低而發(fā)生的一種乳酸發(fā)酵機(jī)制,葡萄糖經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸,但丙酮酸的代謝途徑發(fā)生了改變,除生成乳酸外,還生成了甲酸等副產(chǎn)物。傳統(tǒng)意義上的乳酸發(fā)酵類(lèi)型是針對(duì)乳酸細(xì)菌而言的,是在厭氧或兼性厭氧條件下合成乳酸的。而根霉作為好氧菌,其乳酸發(fā)酵具有獨(dú)特的代謝途徑。它是經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸,然后一部分丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán),而另一部分丙酮酸在乳酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分別生成乳酸、乙醇、蘋(píng)果酸和富馬酸。依據(jù)形成產(chǎn)物情況,該發(fā)酵也屬于混合酸發(fā)酵類(lèi)型。1.4乳酸生產(chǎn)方法的比較化學(xué)合成法的缺點(diǎn)是產(chǎn)品為外消旋乳酸,即DL-乳酸。另外,由于合成法所用原料是乙醛和劇毒物氫氰酸,盡管美國(guó)食品和藥物管理局已將合成乳酸列為安全產(chǎn)品,但發(fā)達(dá)國(guó)家還是不能放心使用合成法制得的乳酸,因而合成法生產(chǎn)乳酸受到大大的限制。此外,其生產(chǎn)成本也較高。酶法生產(chǎn)乳酸雖然可以得到單一旋光性的乳酸,但工藝比較復(fù)雜,其在工業(yè)上的應(yīng)用還有待于進(jìn)一步研究。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸,可通過(guò)菌種選育或代謝調(diào)控而獲得具有立體單一的D-乳酸和L-乳酸,或兩種異構(gòu)體以一定比例混合的消旋體,以滿足生產(chǎn)聚乳酸的需要。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸因其原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品光學(xué)純度高和安全性好等優(yōu)點(diǎn)而成為生產(chǎn)乳酸的重要方法。2乳酸生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步微生物發(fā)酵法是目前乳酸生產(chǎn)的主要方法。雖然發(fā)酵法乳酸生產(chǎn)技術(shù)在日益進(jìn)步,但乳酸的生產(chǎn)成本仍需進(jìn)一步降低,才能夠擴(kuò)大乳酸的應(yīng)用前景。在降低乳酸成本方面,關(guān)鍵還是菌種水平的提高和發(fā)酵工藝技術(shù)的改進(jìn)。2.1根霉發(fā)酵生產(chǎn)乳酸自然界中可發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的微生物很多,但產(chǎn)酸能力強(qiáng)、可應(yīng)用到工業(yè)上的主要有霉菌中的根霉屬及細(xì)菌中的乳酸菌類(lèi)等。根霉屬中的米根霉是生產(chǎn)L-乳酸的理想菌種。國(guó)內(nèi)外對(duì)于米根霉的選育工作作了大量的報(bào)道。Yu等對(duì)米根霉直接發(fā)酵農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行了研究,以碳酸鈣為中和劑,每千克粗淀粉原料可生成350g以上的L-乳酸,并申請(qǐng)了美國(guó)專(zhuān)利。我國(guó)天津、江蘇、浙江、山西等地的許多科技工作者對(duì)米根霉的乳酸發(fā)酵進(jìn)行了研究。江蘇微生物研究所的曹本昌等選育了一株產(chǎn)L-乳酸的根霉JSMI-R73,對(duì)該菌性能及產(chǎn)酸的條件進(jìn)行了研究。在500L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大實(shí)驗(yàn),當(dāng)葡萄糖濃度為10%時(shí)產(chǎn)酸70g/L;13%時(shí)產(chǎn)酸101g/L以上。該菌可以玉米粉作為培養(yǎng)基,當(dāng)玉米粉濃度為12%時(shí)產(chǎn)酸70g/L以上;20%時(shí)產(chǎn)酸105g/L以上。其中L-乳酸的純度最高達(dá)99%。山西微生物研究所蔣明珠等從56株根霉中篩選出10株產(chǎn)L-乳酸較高的菌株,其中根霉R-47產(chǎn)L-乳酸最高,產(chǎn)酸穩(wěn)定,在搖瓶培養(yǎng)條件下,初始葡萄糖濃度為15%,35℃、48h產(chǎn)L-乳酸達(dá)118.4g/L,對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)78.9%。福州大學(xué)楊虹等利用淀粉-酸性培養(yǎng)基富集培養(yǎng),并結(jié)合高錳酸鉀-溴化鉀平板檢出的方法從土壤中篩選出產(chǎn)乳酸為81g/L的根霉R-2菌株,以其為出發(fā)菌株經(jīng)紫外線誘變,從琥珀酸平板上獲得R-2-91,以葡萄糖為碳源的情況下產(chǎn)酸103g/L,對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為68.9%。中科院等離子研究所古紹彬等以葡萄糖為碳源對(duì)PW352菌株特性進(jìn)行了研究,并在此基礎(chǔ)上采用離子束誘變方法,對(duì)米根霉PW352進(jìn)行改良,獲得高產(chǎn)L-乳酸菌株RE3303,產(chǎn)酸能力達(dá)131g/L~136g/L,最高可達(dá)140g/L,糖轉(zhuǎn)化率為86%~90%,產(chǎn)酸比PW352提高75%。根霉發(fā)酵為混合酸發(fā)酵,對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率理論值為75%,與細(xì)菌乳酸發(fā)酵理論轉(zhuǎn)化率100%相比相差得比較多,且根霉發(fā)酵生產(chǎn)乳酸需要通氣攪拌,動(dòng)力消耗比較大,通風(fēng)攪拌費(fèi)用比較高。細(xì)菌發(fā)酵乳酸可以在兼性厭氧條件下靜置發(fā)酵,可減少通氣的能量消耗,降低成本。在發(fā)酵工藝方面,根霉發(fā)酵生產(chǎn)乳酸主要采用的工藝是氣升式反應(yīng)器和固定化方法,而細(xì)菌乳酸發(fā)酵可以和產(chǎn)物提取相耦合,采用原位分離技術(shù)在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行產(chǎn)物提取,減少工藝流程。因此現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外都展開(kāi)了對(duì)細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究,以發(fā)揮細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的優(yōu)勢(shì),彌補(bǔ)根霉發(fā)酵L-乳酸所存在的缺陷和不足。Zhang等研究了食淀粉乳桿菌NRRLB4542直接從淀粉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的條件,淀粉的起始濃度為120g/L,從液化淀粉出發(fā),可在20h生產(chǎn)出濃度為96.2g/L的乳酸。Hujanen等對(duì)干酪乳桿菌NRRLB-441產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行優(yōu)化,在160g/L葡萄糖時(shí),最高乳酸濃度達(dá)到118.6g/L。他們采用廉價(jià)的大麥芽提取物加少量酵母膏(4g/L)取代單獨(dú)使用酵母膏(22g/L),大大地節(jié)省了生產(chǎn)成本。徐子鈞以代謝調(diào)控發(fā)酵理論為依據(jù),利用紫外線、亞硝基肌、DES等理化因子對(duì)從自然界篩選到的乳酸菌進(jìn)行復(fù)合誘變,再用高濃乳酸鈣平板、純?nèi)樗崞桨?、琥珀酸平板篩選得到一株高產(chǎn)L-乳酸的正向突變株M7,平均發(fā)酵產(chǎn)量為90g/L,比原菌株產(chǎn)量提高30%,對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率為88.9%。樂(lè)曉潔等利用紫外線誘變方法,對(duì)出發(fā)菌株干酪乳桿菌YBQ1-1進(jìn)行誘變處理,篩選得到一株正向突變株YBQH2-14,其L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到93g/L,對(duì)糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到77.5%,比出發(fā)菌株產(chǎn)酸提高48.5%。近年來(lái)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸受到關(guān)注。Danner等采用嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株FA6和IFA9,以葡萄糖為碳源,分批培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸,轉(zhuǎn)化率分別為84.0%和98.7%。Payot等報(bào)道:篩選到能在52℃生長(zhǎng)的一株凝結(jié)芽孢桿菌TB04,能在培養(yǎng)基不滅菌的條件下發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,經(jīng)條件優(yōu)化,乳酸的最終濃度為55g/L,轉(zhuǎn)化率為92%。路福平等發(fā)表了芽孢乳酸菌凝結(jié)芽孢桿菌TQ33的篩選及產(chǎn)酸條件研究結(jié)果,其最適生長(zhǎng)溫度45℃~50℃,厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖為L(zhǎng)-乳酸,72h產(chǎn)酸量最高達(dá)到67.8g/L,其中L-乳酸占96%以上。上述幾種芽孢桿菌產(chǎn)乳酸量尚低,暫無(wú)實(shí)際應(yīng)用的可能,但可望通過(guò)補(bǔ)料發(fā)酵,或采用發(fā)酵和微過(guò)濾膜組件耦合的高細(xì)胞密度生物反應(yīng)器,使細(xì)胞濃度增加,則乳酸的產(chǎn)率和發(fā)酵效率均會(huì)增加。由于培養(yǎng)基可以不必滅菌,將可以節(jié)省能源,降低成本。隨著基因工程的發(fā)展,通過(guò)改變菌株的代謝途徑,選育出L-乳酸的高產(chǎn)菌株,也成為一種重要的育種手段。Dong等報(bào)道了基因工程菌E.coliRR1的構(gòu)建研究結(jié)果。從干酪乳桿菌中提取的L-乳酸脫氫酶被轉(zhuǎn)入到缺少D-乳酸脫氫酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的受體菌株中,這個(gè)重新整合的菌體只產(chǎn)生L-乳酸,而不產(chǎn)生D-乳酸。Hakki等報(bào)道了米根霉的基因工程菌構(gòu)建的研究結(jié)果。作者采用乳鏈乳球菌的乳酸脫氫酶基因的DNA序列設(shè)計(jì)了引物,采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增了米根霉乳酸脫氫酶基因的片斷,編碼接近72%,以此為基礎(chǔ)進(jìn)行米根霉基因工程菌生產(chǎn)乳酸的開(kāi)發(fā)研究。2.2固定化米根霉發(fā)酵發(fā)酵在乳酸發(fā)酵過(guò)程中,不斷生成乳酸使發(fā)酵液pH值逐漸降低,導(dǎo)致對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸的形成產(chǎn)生抑制作用,為此不得不加入碳酸鈣等中和劑進(jìn)行中和,這不僅增加分離提取的困難,而且影響產(chǎn)品質(zhì)量,并造成嚴(yán)重的污染。為了提高乳酸產(chǎn)率,改進(jìn)分離過(guò)程,近年來(lái)圍繞乳酸生產(chǎn)各個(gè)單元過(guò)程發(fā)展了許多技術(shù),如采用半間歇或連續(xù)操作提高生產(chǎn)率;采用固定化技術(shù)或細(xì)胞循環(huán)反應(yīng)器得到高濃度細(xì)胞提高產(chǎn)量;采用發(fā)酵分離耦合的萃取發(fā)酵技術(shù)等。林建平等對(duì)轉(zhuǎn)盤(pán)反應(yīng)器固定化米根霉的L-乳酸發(fā)酵進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:此法進(jìn)行乳酸發(fā)酵具有發(fā)酵速度快、得率高以及既能用于連續(xù)發(fā)酵又能用于間歇發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)他們利用發(fā)酵與離子交換分離耦合技術(shù)進(jìn)行乳酸發(fā)酵研究,簡(jiǎn)化了后續(xù)分離步驟。天津大學(xué)孫彥等采用聚氨酯泡沫法固定化米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸,速率比游離菌提高了3倍。固定化方法簡(jiǎn)單易行,所制得的細(xì)胞穩(wěn)定性強(qiáng),容易擴(kuò)大生產(chǎn)。Yin等采用氣升式發(fā)酵罐接種米根霉發(fā)酵,由玉米淀粉直接生產(chǎn)L-乳酸,所得乳酸的質(zhì)量濃度為102g/L,得率為85%。Hang和Hamamci等分別對(duì)海藻酸鈣和海藻酸鈉固定化米根霉生產(chǎn)乳酸進(jìn)行了研究。Tamda等將米根霉細(xì)胞固定化到以聚二甲基丙烯酸乙二醇酯為單體用γ射線誘導(dǎo)得到的高分子載體上,固定化后的乳酸得率大于65%,產(chǎn)酸速率比游離菌高1.8倍。Chen等使用微孔中空纖維膜(MHF)溶劑萃取法,連續(xù)原位萃取乳酸。發(fā)酵菌種用德氏乳桿菌NRRLB445,乳酸發(fā)酵原料用纖維素等,硫酸水解預(yù)處理。加纖維素酶同時(shí)糖化萃取發(fā)酵(SSEF),這種工藝實(shí)際是兩個(gè)工藝的組合:發(fā)酵液的SSF和流經(jīng)MHF的萃取工藝。Models等由SSF一步法把桉樹(shù)木屑轉(zhuǎn)化為乳酸時(shí),采取多次添加底物、補(bǔ)充新鮮營(yíng)養(yǎng)和酶、及時(shí)除去乳酸等綜合措施,能使酸預(yù)處理過(guò)的木材轉(zhuǎn)化為乳酸的效率提高。67%的纖維素轉(zhuǎn)化為乳酸,最大乳酸濃度為108g/L,產(chǎn)率是0.94g/(L·h)。采用流加SSF培養(yǎng)可保持培養(yǎng)基中的低葡萄糖濃度和低乳酸濃度,以避免對(duì)酶活性和微生物代謝的抑制。另外,Models等將SSF技術(shù)與離子交換樹(shù)脂吸附發(fā)酵液中乳酸相耦合,系統(tǒng)運(yùn)作20h,乳酸產(chǎn)率達(dá)1.18g/(L·h)。Danner等設(shè)計(jì)了超濾膜生物反應(yīng)器(MR)耦聯(lián)-單極電滲析箱(ED),構(gòu)成MBR-ED單元操作系統(tǒng),對(duì)從堆肥中篩選出來(lái)能利用己糖和戊糖的嗜熱脂肪芽孢桿菌BS119進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的研究。這一MBR-ED單元操作系統(tǒng)使乳酸濃度達(dá)到115g/L。在運(yùn)行1052h后并未測(cè)出有微生物的污染。Cotton等采用固定化細(xì)胞生物膜反應(yīng)器研究乳酸的生成,載體稱為塑料復(fù)合載體(PCS)。PCS生物膜反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是增加乳酸產(chǎn)率,把延遲期縮至最短,耐高濃度葡萄糖,降低對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要以及增加細(xì)胞密度。3乳酸生產(chǎn)技術(shù)基于乳酸的優(yōu)良特性與廣泛用途,本應(yīng)成為大宗產(chǎn)品與商品,然而從1780年首次發(fā)現(xiàn)乳酸,至今已有很長(zhǎng)的歷史,直到2002年,全世界乳酸年產(chǎn)量?jī)H有12萬(wàn)t。主要原因有二:①發(fā)酵水平尚不夠高,產(chǎn)品分離提取困難,導(dǎo)致乳酸價(jià)格高,使之受到市場(chǎng)機(jī)制的制約;②在乳酸轉(zhuǎn)化成乳酸聚合物、丙烯酸類(lèi)聚合物以及丙二醇、乙醇等小分子化合物方面存在著許多技術(shù)上的困難,從而限制了乳酸的應(yīng)用范圍。因此,建議今后應(yīng)從以下方面入手進(jìn)一步開(kāi)展研究工作,以降低乳酸的生產(chǎn)成本,擴(kuò)大乳酸的應(yīng)用范圍。3.1挖掘和選育優(yōu)良菌株菌種是發(fā)酵工業(yè)的生命,一株優(yōu)良的生產(chǎn)菌株可極大地提高產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。因此,一方面應(yīng)該繼續(xù)進(jìn)行野生型乳酸產(chǎn)生菌株的篩選開(kāi)發(fā)工作,發(fā)掘自然微生物資源中的優(yōu)良菌株;另一方面大力開(kāi)展已開(kāi)發(fā)菌株的育種工作。今后,L-乳酸產(chǎn)生菌株的育種