污水短程生物脫氮系統(tǒng)中硝化菌群的定性與定量化分析

污水短程生物脫氮系統(tǒng)中硝化菌群的定性與定量化分析

近年來，生物分子的快速發(fā)展為生物福利微生物的研究提供了一種新的分析技術(shù)和方法。通過傳統(tǒng)的純分離方法，可以分析和定量評估復(fù)雜微生物的結(jié)構(gòu)。例如，對于生物福利的研究，有許多關(guān)于縮短反應(yīng)的文獻報告，例如對硫酸鹽還原菌（kaneetal.1993）、線性菌（wagneretal.1994）、聚磷菌（cytstall，1998）、硝化菌（damiseal.，2001）等。短程脫氮是生物脫氮新理論和先鋒科學(xué)的之一。對于實現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵是限制硝化菌（aob）和nob（nitroll，1998）的結(jié)構(gòu)分布和生物活性的動態(tài)變化。這是建立有效的調(diào)節(jié)機制的前提和基礎(chǔ)。然而，另一方面，研究主要集中在對亞硝酸鹽積累率的影響因素的研究上，對硝化菌群落（aob）的結(jié)構(gòu)分布和動態(tài)變化非常重要。這是建立有效的控制機制的前提和基礎(chǔ)。然而，在目前的研究中，我們主要集中在對亞硝酸鹽積累率影響因素的研究上，我們很少參與短期脫氮過程中硝化菌群落的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分析，也沒有明確的認(rèn)識和理解“微生物”的直觀和清晰的理解和理解（zhenghaial.，2004；maetal.，2004；劉秀紅等，2004）。因此，在短程脫氮系統(tǒng)特征研究的基礎(chǔ)上，需要進一步研究硝化菌群的結(jié)構(gòu)組成和空間分布，為短程脫氮的優(yōu)化控制策略奠定基礎(chǔ)。1材料和方法杏仁1.1小型反應(yīng)器中亞硝酸鹽提取污泥樣品來自于4種不同的污水短程生物脫氮系統(tǒng).(1)SBR大型中試反應(yīng)器:有效容積54m3,運行溫度13℃,亞硝酸鹽積累率95%,好氧HRT實時控制是實現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵因素;(2)UASB-A/O小型反應(yīng)器:A/O有效容積15L,亞硝酸鹽積累率98%,高濃度的游離氨(FA)抑制和好氧HRT實時控制是實現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵因素;(3)A/O中試反應(yīng)器:有效容積300L,污泥齡15～20d,運行溫度22～23℃,好氧區(qū)平均DO濃度0.57mg·L-1.亞硝酸鹽積累率80%,經(jīng)分析DO濃度和好氧HRT實時控制是實現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵因素;(4)SBR小型反應(yīng)器:有效容積12L,運行溫度28℃,DO濃度2mg·L-1以上,亞硝酸鹽積累率95%,溫度和好氧HRT實時控制是實現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵因素.除了UASB-A/O反應(yīng)器處理實際垃圾滲濾液之外,其余3種反應(yīng)器均處理實際生活污水.1.2雜交緩沖液和探針的制備按照Amann的操作方法進行Fish分析.采用4%PFA,4℃條件下對污泥樣品固定2～3h.對固定后的污泥樣品超聲分散1min,將樣品滴加在明膠包被過的載玻片上,空氣中干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脫水3min.雜交緩沖液組成包括0.9mol·L-1NaCl、20mmol·L-1Tris/HCl,0.01%SDS和甲酰胺(甲酰胺FA濃度見表1),pH7.2.將熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針溶解于雜交緩沖液中,在46℃下與污泥樣品雜交2h.采用的寡核苷酸探針列于表1.雜交結(jié)束后,采用洗脫緩沖液在48℃下洗脫20min.在干燥后的樣品上滴加抗熒光衰減液,對每個污泥樣品隨機拍攝20～25張照片(OLYMPUSBX52熒光顯微鏡)用于定量分析(LeicaQWINSoftware).1.3pcr擴增條件及dage分析采用FastDNAspinkitforsoil(Bio101,USA)進行污泥樣品的DNA提取.PCR引物采用AmoA-1F-Clamp(5’-Clamp-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’)和AmoA-2R-TC(5’-CCCCTCTGCAAAGCCTTCTTC-3’),特異性擴增AOB.PCR混合液(50μL體系):35.5μLdH2O,5μLPCR緩沖液,1μL正向引物(50pmol·μL),1μL反向引物(50pmol·μL),0.5μL5UTaqDNA聚合酶,5μLdNTP(1.25mmol·L-1),2μLDNA模板.PCR反應(yīng)條件:95℃下10min,35個循環(huán)(94℃下15s,55℃下20s,72℃下2min),最后72℃下延伸5min.采用DcodeSystem(BioRad)對AmoAPCR產(chǎn)物進行DGGE分析.分別準(zhǔn)備2種變性劑濃度的凝膠溶液30%和70%,在100V、60℃、1×TAE緩沖液中運行15h.VistraGreen染色凝膠20min,然后在FluorImage595成像系統(tǒng)中進行觀察.1.4pcr擴增條件PCR引物采用標(biāo)準(zhǔn)的AmoA-1F(5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’)和AmoA-2R(5’-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3’),特異性擴增AOB.PCR混合液(50μL體系):1×PCR緩沖液,0.25μmol·L-1正向引物,0.25μmol·L-1反向引物,1.25UTaqDNA聚合酶,0.2mmol·L-1dNTPs.PCR反應(yīng)條件與1.3節(jié)相同.2結(jié)果resource2.1a/o中試反應(yīng)器中亞硝酸鹽積累率80%,nob4種短程生物脫氮系統(tǒng)的Fish定量分析結(jié)果分別是:SBR大型中試反應(yīng)器中(亞硝酸鹽積累率95%)AOB為總菌群數(shù)的3%,沒有檢測出NOB;UASB-A/O小型反應(yīng)器中(亞硝酸鹽積累率98%)AOB占總菌群數(shù)的4%,NOB低于總菌群數(shù)的0.2%;A/O中試反應(yīng)器中(亞硝酸鹽積累率80%)AOB為總菌群數(shù)的5%,NOB低于0.2%;SBR小型反應(yīng)器中(亞硝酸鹽積累率95%)AOB為總菌群數(shù)的12%,沒有檢測出NOB.Fish定量結(jié)果表明,在亞硝酸鹽積累率高于80%后,AOB在活性污泥中所占的比例與亞硝酸鹽積累率沒有明顯的相關(guān)性,但AOB相比于NOB已成為明顯的優(yōu)勢菌群,或者已實現(xiàn)從系統(tǒng)中淘汰NOB.Fish檢測結(jié)果如圖1、圖2所示.對NOB的檢測,只有A/O中試反應(yīng)器和UASB-A/O小型反應(yīng)器中存在極少量的NOB,而且NOB種類不同.A/O中試反應(yīng)器檢測出的NOB屬于Nitrospira,UASB-A/O小型反應(yīng)器中的NOB屬于Nitrobacteria.2.2dppe條帶分析A/O中試反應(yīng)器、SBR大型中試反應(yīng)器和UASB-A/O小型反應(yīng)器3種污泥樣品的DGGE分析結(jié)果如圖3所示,每種污泥樣品同時做4個平行樣,每種污泥樣品DGGE條帶的重現(xiàn)性很好.由于PCR引物的目標(biāo)序列是AOB的功能基因AmoA,因此DGGE凝膠上標(biāo)記的主要條帶應(yīng)屬于AOB.A/O中試反應(yīng)器和SBR大型中試反應(yīng)器的DGGE條帶模式非常相似,例如條帶2和8、3和9、4和10出現(xiàn)在相同的變性梯度位置上.UASB-A/O小型反應(yīng)器的條帶模式明顯不同.造成這種差異的主要原因可能是廢水水質(zhì)的不同,A/O和SBR反應(yīng)器分別處理生活污水和城市污水,水質(zhì)相近,而UASB-A/O反應(yīng)器處理城市垃圾滲濾液,從而使不同處理系統(tǒng)的AOB的種類有所不同.3種污泥樣品DGGE條帶的共同特點是均出現(xiàn)在變性劑濃度30%～50%的范圍內(nèi),根據(jù)文獻資料,在該變性劑濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)的條帶應(yīng)屬于Nitrosomonas-like(Nicolasenetal.,2002).由于DGGE分析結(jié)果所能提供的信息是有限的,無法在“種”的水平上確定AOB的種類.如要獲得更為準(zhǔn)確的分析結(jié)果,需要切割DGGE條帶,繼續(xù)進行PCR-DGGE-Cloning-Sequencing分析,從而確定AOB的種類.2.3blast實現(xiàn)序列分析對SBR中試反應(yīng)器的污泥樣品進行PCR-Cloning-sequencing分析.由于PCR引物的目標(biāo)序列是AOB的功能基因AmoA,因此陽性克隆體的外源基因片段為AmoA基因,測序分析及序列對比分析都是針對AOB的AmoA基因序列.選取8個陽性克隆體(E8、E9、F8、E12、F11、F12、C9、D8)的測序結(jié)果進行BLASTsearch的相似性分析,結(jié)果如下:E8與Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度為88%;E9與Nitrosomonassp基因序列的相似程度為82%;F8與Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度為88%;E12與Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度為88%;F11與Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度為88%;F12與Nitrosomonaseuropaea基因序列的相似程度為88%;C9與Nitrosomonassp基因序列的相似程度為84%;D8與Nitrosomonassp.基因序列的相似程度為98%.所有的克隆相似于Nitrosomonas,這與PCR-DGGE分析結(jié)果完全一致,其中60%以上的克隆相似于Nitrosomonaseuropaea.采用ClustalW進行目標(biāo)序列和相關(guān)性序列的對比分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4所示.3u3000自身缺陷1)采用Fish對SBR大型中試反應(yīng)器、UASB-A/O小型反應(yīng)器、A/O中試反應(yīng)器和SBR小型反應(yīng)器4種污水短程生物脫氮系統(tǒng)的AOB與NOB進行初步定量分析.在4種短程脫氮系統(tǒng)中,AOB相比于NOB已成為明顯的優(yōu)勢菌群,占總菌群的3%～12%.在SBR中試和小試反應(yīng)器中沒有檢測出NOB,已實現(xiàn)從系統(tǒng)中淘汰NOB.A/O中試反應(yīng)器中存在極少量的Nitrospira(<0.2%),而UASB-A/O小型反應(yīng)器中存在極少量的Nitrobacteria(<0.2%).2)采用PCR-DGGE對SBR大型中試反應(yīng)器、UASB-A/O小型反應(yīng)器和A/O中試反應(yīng)器的污泥樣品中的AOB做初步定性分析,DGGE結(jié)果顯示3種短程脫氮系統(tǒng)中的AOB均以Nitrosomonas-like為主.SBR大型中試反應(yīng)器中污泥樣品的PCR-Cloning-Se