高活性自養(yǎng)反硝化菌的分離鑒定及其硝酸鹽還原特性研究

高活性自養(yǎng)反硝化菌的分離鑒定及其硝酸鹽還原特性研究

在循環(huán)水環(huán)境控制（ras）中，氨氮主要通過(guò)硝化作用將氨氮轉(zhuǎn)化為鹽酸氮，最大亞硝酸鹽氮濃度可達(dá)到400-500mg。然而，大量亞硝酸鹽氮主要通過(guò)更換水和其他方式排放至循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。近年來(lái)，鹽酸氮的毒性和凈化劑已成為研究的重點(diǎn)。根據(jù)大量研究，高濃度亞硝酸鹽氮容易導(dǎo)致水生生物的生長(zhǎng)速度、易受疾病、發(fā)育緩慢、繁殖力和成活率下降。因此，建議將循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氮濃度控制在50mg左右。因此，環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氮濃度控制非常重要。盡管異養(yǎng)反硝化工藝研究較多,但對(duì)于循環(huán)養(yǎng)殖水這種C/N低于1的特殊水體,采用該工藝將導(dǎo)致運(yùn)行費(fèi)用高及運(yùn)行管理困難等問(wèn)題.自養(yǎng)反硝化細(xì)菌,特別是脫氮硫桿菌(Thiobacillusdenitrificans)的發(fā)現(xiàn)引起了研究者的普遍關(guān)注,對(duì)自養(yǎng)反硝化的報(bào)道,主要集中在反硝化工藝方面,而對(duì)于脫氮硫桿菌生理生化以及反硝化特性方面的報(bào)道較少.脫氮硫桿菌作為硫自養(yǎng)反硝化菌,其生物特性和硝酸鹽降解特性的研究對(duì)于該菌在實(shí)際生產(chǎn)中的開發(fā)應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義.本研究通過(guò)定向富集,從土壤中分離獲得1株具有較高反硝化活性的化能自養(yǎng)菌TD,生理生化和分子生物學(xué)鑒定其為脫氮硫桿菌,并在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)該菌的反硝化特性進(jìn)行了分析,以期為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中高濃度硝酸鹽氮的控制提供理論依據(jù).1材料和方法1.1細(xì)菌的豐富和分離1.1.1培養(yǎng)基的制備基本培養(yǎng)基:Na2S2O3·5H2O5g,KNO32g,KH2PO42g,NaHCO31g,MgCl2·6H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,用蒸餾水定容至1L.121℃滅菌30min備用.富集培養(yǎng)基按照2×基本培養(yǎng)基組成配制.向基本培養(yǎng)基中加入18g/L瓊脂粉,加熱溶解后121℃滅菌20min,制作分離平板培養(yǎng)基.1.1.2菌株純化及培養(yǎng)取上海市復(fù)興島公園內(nèi)的土壤(約地表下15cm),以1g/L的比例放入富集培養(yǎng)基,靜態(tài)培養(yǎng),培養(yǎng)溫度28℃.定時(shí)轉(zhuǎn)接,富集培養(yǎng)物被系列稀釋后涂布平板,28℃培養(yǎng),根據(jù)菌落特征差異挑取單菌落于液體培養(yǎng)基再次培養(yǎng).如此重復(fù)直至在顯微鏡下只能觀察到單一的目的菌.將純化菌種斜面劃線培養(yǎng)并保存,以備后用.1.2srdna擴(kuò)增1.2.1分離菌株的透射電鏡觀察1.2.2菌種的生理生化鑒定采用生化反應(yīng)管測(cè)定分離菌株TD的生理生化指標(biāo),并參照文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定.1.2.316SrDNA同源性(1)總DNA提取取對(duì)數(shù)期的菌液50mL,離心收集菌體,抽提基因組總DNA.加500μL裂解緩沖液(50mmol/LTrispH8.0,20mmol/LEDTA,50mmol/LSucrose)重懸細(xì)胞,再加入溶菌酶至終溶度10mg/mL,37℃水浴10min.加入SDS至終溶度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),蛋白酶K至終溶度為100μg/mL,37℃繼續(xù)處理30min.酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提,2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA,最后用不含DNase的RNaseA除去RNA.DNA樣品可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增.(2)細(xì)菌16SrDNA全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增參照Bosshard等的方法進(jìn)行.細(xì)菌通用引物序列如下:8f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,產(chǎn)生相應(yīng)于大腸桿菌(Escherichiacoli)16SrDNA序列核苷酸位置8～1510的PCR產(chǎn)物.25μLPCR反應(yīng)體系中,包括:2.5μL10ⅹPCR反應(yīng)緩沖液,1μL2.5mmol/LdNTP,1UTaq酶,各1μL6.25mmol/L的上下引物,DNA模板為50ng.PCR反應(yīng)經(jīng)95℃預(yù)變性5min后,進(jìn)行30個(gè)循環(huán):95℃1min,50℃1min,72℃延伸2min.最后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物置于-20℃下保存?zhèn)溆?作為擴(kuò)增分離菌種16SrDNA片斷的模板.(3)16SrDNA序列的鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)連接,轉(zhuǎn)化,陽(yáng)性克隆篩選,將含有正確轉(zhuǎn)化片斷的菌體培養(yǎng)液送至上海生物工程服務(wù)公司測(cè)序.最后將測(cè)定的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.1.3溫度和ph值對(duì)分離菌株生長(zhǎng)和反硝化代謝的影響1.3.1初始ph值對(duì)菌株抗氧化酶活性的影響在250mL三角瓶中裝入100mL培養(yǎng)液,硝酸鹽氮濃度設(shè)定為35mg/L,初始pH值依次調(diào)控至為1、2、3、4、5、6、7、8、9,在28℃下以120r/min振蕩培養(yǎng),通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的D(opticaldensity,λ=610nm)值和硝酸鹽氮降解率的變化來(lái)判斷菌體的生長(zhǎng)和代謝情況.1.3.2選擇最佳生長(zhǎng)溫度和反硝化溫度的菌株試驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.3.1,溫度依次設(shè)定為10、15、20、25、30、35、40℃.1.4硝酸鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的制備以硝酸鹽氮為唯一氮源,將菌種按體積分?jǐn)?shù)1%的量接種到含有35mg/L硝酸鹽氮的液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng),100h補(bǔ)加硝酸鹽氮至89.44g/L,繼續(xù)培養(yǎng).每隔8h檢測(cè)其中硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮的含量、菌體的濁度以及培養(yǎng)基的pH值.1.5硝酸鹽降解活性測(cè)定用去離子水配制鹽度分別為0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的人工海水,加入1.1.1所述培養(yǎng)基成分制作液體培養(yǎng)基,將菌種按體積分?jǐn)?shù)1%的量接種到含有35mg/L硝酸鹽氮液體的培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng).每8h檢測(cè)1次硝酸鹽氮,記錄硝酸鹽完全去除所需時(shí)間和72h內(nèi)的硝酸鹽氮降解率.1.6分離菌株的快速毒性實(shí)驗(yàn)1.6.1菌懸液的制備將已純化的菌株接種在平板上,28℃培養(yǎng)72h后,用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔,用細(xì)菌比濁儀依次調(diào)整菌液濃度至10×109～10×103CFU/mL.1.6.2人工感染試驗(yàn)選擇無(wú)外傷、游動(dòng)活潑的鯽魚(平均體長(zhǎng)12cm,平均體重55g)為供試魚,飼養(yǎng)5d后,以肌肉注射和魚體擦傷浸泡進(jìn)行攻毒感染.肌肉注射菌株TD的不同濃度菌液,分為5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,對(duì)照組用無(wú)菌生理鹽水.浸泡感染試驗(yàn)2個(gè)試驗(yàn)組,用菌液以擦傷魚體感染,1個(gè)對(duì)照組同環(huán)境養(yǎng)殖.每組用魚均為10尾.試驗(yàn)期間不喂飼料,水溫控制在25℃.人工感染試驗(yàn)結(jié)束后,連續(xù)觀察2周,記錄死亡情況,如出現(xiàn)供試魚死亡現(xiàn)象,采用Reed-Muench法計(jì)算半致死濃度LC50.1.7檢測(cè)方法硝酸鹽氮:紫外分光光度法;亞硝酸鹽氮:N-(1-萘基)-乙二胺光度法.2速降解硝酸鹽氮菌株經(jīng)過(guò)定向富集,得到1株在接種后72h即產(chǎn)生大量氣泡,迅速降解硝酸鹽氮的菌株,命名為TD.該菌好氣下生長(zhǎng)緩慢,菌落僅有針尖大小,透明;厭氧培養(yǎng)菌落直徑約0.5～1mm,圓形,白色或半透明,扁平且潤(rùn)濕(圖1).異養(yǎng)培養(yǎng)不生長(zhǎng).2.1通過(guò)分離蘑菇的透射電鏡菌株TD的細(xì)胞呈短桿狀,單個(gè)或短鏈狀排列,以單根極生鞭毛運(yùn)動(dòng),大小約為(0.5～0.8)μm×(1.5～2)μm.2.2德維護(hù)斯的分離2.2.1生理生化的評(píng)價(jià)分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果見表1,根據(jù)形態(tài)、生理生化特征,初步鑒定該菌株屬于硫桿菌屬(Thiobacillus).2.2.2菌株的篩選和鑒定細(xì)菌總DNA與16SrDNA全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2、圖3所示,其中1、2、3為該菌的3個(gè)重復(fù).將測(cè)序結(jié)果與GenBank上已登錄的基因序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)與Thiobacillusdenitrificans同源性最高,為99.85%.利用MEGA3.1軟件,將分離菌株與部分參考菌株基于16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖4).綜合生理生化特性和分子生物學(xué)特性,確定該菌株為脫氮硫桿菌Thiobacillusdenitrificans.2.3溫度和ph值對(duì)脫氮硫菌生長(zhǎng)和反硝化代謝的影響2.3.1ph對(duì)反硝化活性的影響不同起始pH對(duì)脫氮硫桿菌生長(zhǎng)速率和反硝化速率的影響實(shí)驗(yàn)(圖5)發(fā)現(xiàn),pH對(duì)其生長(zhǎng)和反硝化活性的影響基本一致,當(dāng)pH從2升至7時(shí),該菌的生長(zhǎng)速率和反硝化速率逐漸提高;但當(dāng)pH繼續(xù)升至9時(shí),其生長(zhǎng)速率和反硝化速率都不斷下降.對(duì)圖5結(jié)果進(jìn)行非線性擬合,可得脫氮硫桿菌的最適生長(zhǎng)pH為6.90,最適反硝化pH為6.82,二者基本一致.2.3.2溫度對(duì)反硝化活性的影響從圖5可以看出,溫度對(duì)脫氮硫桿菌的生長(zhǎng)和反硝化代謝活性均有明顯影響;溫度對(duì)生長(zhǎng)的影響不同于對(duì)反硝化活性的影響.當(dāng)溫度從10℃升到30℃時(shí),菌體的生長(zhǎng)速率逐漸增大;溫度繼續(xù)升高后,菌體生長(zhǎng)速率減慢.菌體的最適反硝化溫度高于最適生長(zhǎng)溫度.對(duì)圖5結(jié)果進(jìn)行非線性擬合,可得菌株的最適生長(zhǎng)溫度為29.5℃,最適反硝化溫度為32.8℃.2.4脫氮硫細(xì)菌的生長(zhǎng)特性和反硝化性能2.4.1氮硫桿菌的生長(zhǎng)脫氮硫桿菌生長(zhǎng)比較緩慢,沒(méi)有明顯的穩(wěn)定期,這與有關(guān)報(bào)道一致,生長(zhǎng)曲線如圖6所示,該菌要經(jīng)過(guò)約100h的延滯期才能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,由反應(yīng)式(1)可知,脫氮硫桿菌的反硝化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生H+,該時(shí)期細(xì)菌的高速增殖產(chǎn)生的大量H+導(dǎo)致了培養(yǎng)基pH迅速由6.37下降到5.1.經(jīng)過(guò)大約38h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)-硝酸鹽氮的逐漸消耗,加之培養(yǎng)基酸性增加,改變了細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)環(huán)境,細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期,逐漸死亡.0.84S2O2?332-+0.35CO2+NO-3+0.43H2O+0.09NH+4+0.09HCO-3→0.09C5H7O2N+0.5N2+1.7SO2?442-+0.069H+(1)2.4.2脫氮硫菌的反硝化特性(1)硝酸鹽降解速率菌株在以硝酸鹽氮為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),溶液中硝酸鹽氮濃度的變化曲線如圖7所示,可以看出,在菌體的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中,脫氮硫桿菌均具有降解硝酸鹽氮的能力,但在菌體生長(zhǎng)的不同階段所表現(xiàn)出的硝酸鹽氮降解速率卻明顯不同(如圖8),該菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段的反硝化能力最強(qiáng),硝酸鹽氮的降解速率最快,達(dá)到了2.245mg·(L·h)-1,大約是其在延滯期的硝酸鹽氮降解速率的5倍,到了衰亡期,隨著底物濃度的減少,同時(shí)也由于酶的耐受時(shí)間過(guò)長(zhǎng),硝酸鹽氮降解速率最慢,只有其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1/10.(2)硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌株在以硝酸鹽氮為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),溶液中亞硝酸鹽氮濃度的變化曲線如圖9所示,可以看出,在脫氮硫桿菌生長(zhǎng)的延滯期,隨著硝酸鹽氮濃度的下降,亞硝酸鹽氮的含量迅速上升,于40h達(dá)到峰值后逐漸下降,但下降速度比較慢,直到72h硝酸鹽氮降為0mg/L后,亞硝氮的降解速度才明顯加快,并于96h時(shí)降為0mg/L,該現(xiàn)象說(shuō)明菌株先利用硝酸鹽氮作為反硝化電子的供體,即硝酸鹽的還原先于亞硝酸鹽的還原.這一現(xiàn)象在Blaszczyk將1個(gè)從活性污泥中分離的Paracoccusdenitrificans菌株培養(yǎng)于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基時(shí)也被觀察到.他發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)培養(yǎng)基中的硝酸鹽完全耗盡時(shí),亞硝酸鹽才開始被還原.目前,對(duì)于這種現(xiàn)象的解釋主要有2種,一種與生物的優(yōu)先利用原則有關(guān):和亞硝酸鹽相比,以硝酸鹽作為電子受體時(shí),基質(zhì)釋放的能量較高,故菌株優(yōu)先利用硝酸鹽;另一種解釋與反硝化酶系的合成順序有關(guān):Kucera等在Paracoccusdenitrificans中檢出的反硝化酶合成順序?yàn)橄跛猁}還原酶、N2O還原酶和亞硝酸鹽還原酶.在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期補(bǔ)加硝酸鹽氮至89.44mg/L后,溶液中的亞硝酸鹽濃度在4h內(nèi)即達(dá)到峰值,并于8h內(nèi)迅速降為0mg/L,之后溶液中的亞硝酸鹽含量一直保持在很低的濃度,未出現(xiàn)積累.2.5鹽度對(duì)硝酸鹽降解率的影響不同鹽度下脫氮硫桿菌72h內(nèi)的硝酸鹽氮降解率如圖10所示.由圖10可知,在鹽度0%～1.5%條件下,鹽度的增加對(duì)于該菌的硝酸鹽氮降解率幾乎沒(méi)有影響,72h內(nèi)的硝酸鹽氮降解率均達(dá)到95.51%以上,當(dāng)鹽度繼續(xù)增加至2.0%以及更高時(shí),細(xì)菌的硝酸鹽氮降解率出現(xiàn)了逐漸下降的趨勢(shì),當(dāng)鹽度升至3.0%時(shí),硝酸鹽氮降解率降到了35.8%.推測(cè)較高鹽度對(duì)該菌株的反硝化活性有抑制作用.但從圖11的不同鹽度下硝酸鹽氮完全去除時(shí)間看,在鹽度2.0%～3.0%條件下,硝酸鹽氮完全去除時(shí)間差異并不明顯,估計(jì)這是該菌對(duì)高鹽度適應(yīng)的結(jié)果,說(shuō)明該菌對(duì)于較高鹽度具備一定的適應(yīng)性和耐受性.2.6脫氮硫菌的快速中毒實(shí)驗(yàn)由表2和表3結(jié)果可知,在為期2周的實(shí)驗(yàn)期間沒(méi)有出現(xiàn)供試魚死亡現(xiàn)象,脫氮硫桿菌對(duì)健康魚體幾乎無(wú)毒性.3脫氮硫桿菌的鑒定生物脫氮以其無(wú)污染、脫氮徹底和安全等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是目前最經(jīng)濟(jì)、有效、可行性高的水體除氮方法.與異養(yǎng)反硝化相比,自養(yǎng)反硝化不需向水體引入有機(jī)物,可避免對(duì)水的再次污染.近幾年對(duì)于應(yīng)用脫氮硫桿菌的自養(yǎng)反硝化特性進(jìn)行飲用水、地下水和廢水脫氮的研究活躍,而將其應(yīng)用于RAS系統(tǒng)的養(yǎng)殖用水國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道,這是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題.由于硫桿菌屬的種類較多,種間的生化特性差異不大,對(duì)于這些生化特性不典型的菌株,往往很難確定是某一種菌,通過(guò)分子生物學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分類鑒定,成為另一種更具優(yōu)勢(shì)的鑒定手段.本研究在常規(guī)鑒定的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用分子生物學(xué)的方法對(duì)菌株TD進(jìn)行了鑒定,得出了一致的鑒定結(jié)果,說(shuō)明這2種方法在硫桿菌屬內(nèi)種水平的鑒定中可以相互補(bǔ)充,得出更為可靠的鑒定結(jié)果.較高鹽度(>2.0%)對(duì)脫氮硫桿菌的反硝化活性表現(xiàn)出抑制作用.嗜鹽反硝化細(xì)菌數(shù)量較少,主要包括古細(xì)菌中的Haloarcula、Halobacterium、H