海藻酸鈉固定化微球的制備及性質(zhì)研究

海藻酸鈉固定化微球的制備及性質(zhì)研究

固定化微生物技術(shù)具有良好的生物密度、反應(yīng)速度快、處理效率高、操作穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)含油量的處理具有很高的研究?jī)r(jià)值。實(shí)際應(yīng)用中,載體及包埋條件的選擇是固定化微生物在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持一定的強(qiáng)度和微生物活性,降低固定化成本并延長(zhǎng)固定化微生物使用壽命的關(guān)鍵。海藻酸鈉(SA)因具有價(jià)格低廉,對(duì)細(xì)胞相對(duì)毒性小,固定化成形方便,傳質(zhì)性能好,對(duì)微生物細(xì)胞的富集程度高等特點(diǎn),成為目前廢水處理中應(yīng)用最廣的包埋劑之一?；钚蕴孔鳛橐环N非極性吸附劑,來(lái)源豐富,是目前廢水處理中應(yīng)用最廣的吸附劑之一。本實(shí)驗(yàn)采用包埋固定化微生物技術(shù)處理含油廢水,以石油烴降解菌Bbai-1為包埋對(duì)象,以SA為包埋載體,活性炭為吸附劑,CaCl2為交聯(lián)劑,制備海藻酸鈉-活性炭固定化微球?？疾炝撕Ｔ逅徕c濃度,活性炭含量,交聯(lián)時(shí)間及種子菌液濃度對(duì)固定化微球物理性質(zhì)和原油降解率的影響,確定最佳固定化條件,并考察了固定化微球降解原油的最佳接種量、最適pH和鹽度。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1sparapefici數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的石油烴降解菌BrevibacillusparabrevisBbai-1(Gen-BankregistrationnumberisHQ231213),來(lái)自于勝利油田含油污水。1.1.2調(diào)ph5.4%基準(zhǔn)油:用石油醚溶解原油,除瀝青和石蠟等,經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后過(guò)濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將石油醚蒸出(90℃)。放置一段時(shí)間,除去殘余石油醚,即得基準(zhǔn)油。富集培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,尿素3g/L,KH2PO4·3H2O3g/L,NaCl5g/L,酵母粉1g/L,調(diào)pH7~7.5,115℃滅菌15min。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:K2HPO4·3H2O3g/L,NaH2PO43g/L,(NH4)2SO45g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,NaCl5g/L,酵母粉1g/L,調(diào)pH7~7.5,121℃滅菌20min。含油培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基+0.2%的基準(zhǔn)油,121℃滅菌20min。增殖培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,酵母膏3g/L,蛋白胨2g/L,硝酸銨1g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,KCl0.2g/L,調(diào)pH7~7.5,115℃滅菌20min。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1bbai-1的生長(zhǎng)曲線測(cè)量1.2.1.離心10min取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Bbai-1,12000r/min離心10min,無(wú)菌水沖洗兩次,各離心10min。將得到的菌體用無(wú)菌水配制成不同吸光度梯度的菌液,在600nm處測(cè)定各自吸光度值(用OD600表示),然后用MPN法測(cè)定各自的菌濃。以吸光度為橫坐標(biāo),菌濃(106cell/mL)為縱坐標(biāo),得到Bbai-1的菌濃-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線:1.2.1.初始菌濃度的確定將吸光度為0.5的Bbai-1種子菌液10mL接入200mL已滅菌的富集培養(yǎng)基中(稀釋21倍),通過(guò)公式(1)得培養(yǎng)液的初始菌濃為1×106cell/mL。在25℃,pH7,鹽度3%條件下,130r/min培養(yǎng)(以不加種子菌液為空白樣),開(kāi)始每隔1小時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度,最后每隔0.5小時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度,以時(shí)間為橫坐標(biāo),以培養(yǎng)液的吸光度為縱坐標(biāo),繪出Bbai-1菌在富集培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。1.2.2油含量測(cè)定油含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行。1.2.3cacl2種子液的制備配制一定濃度的SA溶液45mL,添加適量活性炭,混勻,121℃滅菌15min,當(dāng)溫度降至30~40℃時(shí),加入5mL處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的一定吸光度的種子菌液(稀釋10倍),用1mL無(wú)菌注射器擠入一定濃度的CaCl2溶液中成形,在4℃冰箱中交聯(lián)24h,用生理鹽水沖洗3遍,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.4關(guān)于碳化合物性質(zhì)的測(cè)定1.2.4.菌液的生物過(guò)濾取10mL處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Bbai-1菌液,離心,用100mL無(wú)菌水配成一定濃度的菌液(稀釋10倍),然后加入3g活性炭,在25℃搖床中動(dòng)態(tài)吸附。每隔1小時(shí),取少量菌液過(guò)濾。用721分光光度計(jì)測(cè)OD600(以不加菌液,其他處理方法同上為空白樣),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出菌液的濃度。1.2.4.菌濃中的菌濃計(jì)算取2份5mLBbai-1種子菌液離心,分別用50mL無(wú)菌水配成一定濃度的菌液,一份以無(wú)菌水為空白測(cè)定OD600,根據(jù)公式(1),得出菌濃c1。另一份加入3g活性炭,于25℃搖床中動(dòng)態(tài)吸附,6h后取菌液過(guò)濾測(cè)定OD600,得出菌濃c2。忽略吸附前后菌液體積的變化,所以單位質(zhì)量的活性炭對(duì)菌Bbai-1的表面吸附量Γ(cell/g)計(jì)算公式為:式(2)中,m為吸附劑的質(zhì)量(g),V為菌液的體積(mL),c1、c2為吸附前后的菌濃(cell/mL)。1.2.5固定化微球性能的測(cè)定1.2.5.1.微球直徑的測(cè)定將制得的微球置于玻璃板上,用游標(biāo)卡尺隨機(jī)測(cè)量50粒微球直徑(mm),取平均值。1.2.5.玻片色質(zhì)量mi將制備好的固定化微球取出大小形狀相近的15粒,置于天平上。在微球上面放一個(gè)載玻片,天平歸零,然后慢慢地壓載玻片,觀察微球直至變形且不能恢復(fù)為準(zhǔn),讀出微球所能承受的最大質(zhì)量Mi,然后換算成壓力Fi(mN)。單個(gè)微球的機(jī)械強(qiáng)度(用壓力表示)為Fi=10Mi/15,分別測(cè)量3組取平均值,即為微球的平均機(jī)械強(qiáng)度:1.2.5.微球的滲透紅墨水法從制得的固定化微球中選取形態(tài)完好、粒徑相同的微球,浸入紅墨水中,每隔5min取球剖開(kāi)并測(cè)定紅墨水滲透的厚度,直到微球被紅墨水完全滲透為止。根據(jù)公式(5)計(jì)算滲透率(%):1.2.5.4-密度計(jì)算方法取50粒大小、形狀相近的微球,稱量記錄質(zhì)量,置于盛有一定體積水的量筒中,記錄體積差。按照密度公式,計(jì)算固定化微球的密度。1.2.6最佳固定化金融的確定在交聯(lián)劑CaCl2溶液濃度為4%,交聯(lián)溫度為4℃,交聯(lián)pH為6~7條件下,考察不同SA濃度(1%、2%、3%、4%、5%),活性炭含量(0.2%、0.5%、0.7%、1%、1.5%),交聯(lián)時(shí)間(12h、18h、24h、30h、36h),種子菌濃(用OD600表示)(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0)對(duì)微球物理性質(zhì)和原油降解率的影響,并通過(guò)正交試驗(yàn),確定固定化微球的最佳制備條件。1.2.7固定化菌和游離菌的降壓條件優(yōu)化1.2.7.固定化菌接種量的確定在25℃,pH7~8,鹽度3%,含油0.2%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,改變固定化微球與含油培養(yǎng)基體積比(1:20、1:10、3:20、1:5、3:10),130r/min搖床中培養(yǎng)7d,分別測(cè)定原油降解率,以確定最佳的固定化菌接種量。1.2.7.游離菌接種將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Bai-1菌液離心,用蒸餾水配制成吸光度為1.5的種子菌液3mL,均分為2份,一份用于固定化微球制備(按實(shí)驗(yàn)方法1.2.3節(jié)中步驟制成15mL加菌微球),另一份用于游離菌接種。(固定化菌以加15mL不含菌微球?yàn)榭瞻讟?游離菌以不加菌液為空白樣)。在25℃,含油0.2%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,130r/min搖床中培養(yǎng)7d,分別測(cè)定不同pH(6、7、8、9、10)和不同鹽度(1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)對(duì)原油降解率的影響,以確定固定化菌和游離菌的最佳降解pH和鹽度范圍。2結(jié)果與討論2.1生長(zhǎng)停位管理由細(xì)菌Bbai-1生長(zhǎng)曲線(圖1)可知,0~2h為生長(zhǎng)停滯期,2~9h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,10h以后為穩(wěn)定期。由于處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌活性最高,因此,對(duì)該菌進(jìn)行固定時(shí),應(yīng)選擇生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Bbai-1作為包埋種子菌液。2.2關(guān)于碳化合物性質(zhì)的測(cè)定2.2.1活性炭吸附時(shí)間的確定由菌濃(吸光度)隨時(shí)間變化曲線(圖2)可知,活性炭在前3小時(shí)的吸附速率較快,6h后吸光度基本不再隨時(shí)間變化,說(shuō)明活性炭對(duì)菌的吸附飽和時(shí)間為6h。2.2.2活性炭對(duì)抗菌性的影響根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.2.3節(jié),測(cè)得活性炭吸附前后Bbai-1的OD600,根據(jù)公式(1)換算成菌濃,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,可測(cè)得活性炭對(duì)菌Bbai-1最大吸附量為1.82×109cell/g。2.2.3球需25min不添加活性炭的微球完全滲透需40min,而添加0.5%活性炭的微球只需25min(圖3)?？梢?jiàn),在固定化微球中添加適量活性炭,能增強(qiáng)載體的通透性,增大固定化顆粒的孔徑,更有利于固定化菌與外界進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧交換,保持活性,使固定化微球的傳質(zhì)性得到明顯提高。2.3采用海藻酸鈉-活性炭固定化微球制備條件2.3.1sa濃度對(duì)固定化微球性能的影響固定CaCl2溶液濃度4%,CaCl2溶液的pH值為6~7,活性炭含量為0.5%,交聯(lián)溫度為4℃,交聯(lián)時(shí)間為24h,包埋菌濃(用OD600表示)為2.0,微球與含油培養(yǎng)基體積比為1:10,原油降解的溫度為25℃,pH為7~8,鹽度為3%。改變SA濃度,測(cè)定微球性能,見(jiàn)表2。由表2可知,固定化微球的半徑、密度和機(jī)械強(qiáng)度均隨SA濃度增加而增大,這是由于溶液粘性與SA濃度成正比,在適當(dāng)?shù)腟A濃度范圍內(nèi)有利于微球成形;當(dāng)SA濃度過(guò)高時(shí),成球不規(guī)則,載體通透性降低,導(dǎo)致原油降解率下降。因此,SA的適宜用量為3%~4%。2.3.2活性炭對(duì)微球降解原油的影響為優(yōu)化海藻酸鈉-活性炭固定化微球的活性炭含量,設(shè)定海藻酸鈉濃度為3%,其他條件同2.3.1節(jié),改變活性炭含量,測(cè)定固定化微球物理性質(zhì)和原油降解率,見(jiàn)表3。由表3可知,隨著活性炭含量的增加,微球的降解率和機(jī)械強(qiáng)度均先增后減。這是由于在微球中添加適量活性炭可提高其傳質(zhì)性,并加速原油和溶解氧在微球表面的吸附平衡,更利于菌保持活性。當(dāng)活性炭含量大于1.5%時(shí),微球在原油降解過(guò)程中會(huì)有大量溶脹,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。因此,活性炭適宜用量為0.5%~1.0%。2.3.3交聯(lián)時(shí)間對(duì)微球降解率的影響為確定海藻酸鈉-活性炭固定化微球的最佳交聯(lián)時(shí)間,設(shè)定SA濃度為3%,活性炭含量為0.5%,其他條件同2.3.1節(jié),改變交聯(lián)時(shí)間,測(cè)定微球的機(jī)械強(qiáng)度和降解率見(jiàn)圖4。由圖4可知,微球的機(jī)械強(qiáng)度隨著交聯(lián)時(shí)間的增加而增大,但原油降解率在交聯(lián)24h后急劇下降。因?yàn)榻宦?lián)時(shí)間過(guò)短,海藻酸鈉凝膠未得到完全交聯(lián),微球機(jī)械強(qiáng)度和微生物活性較低;交聯(lián)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)降低載體的傳質(zhì)性能,且長(zhǎng)時(shí)間低溫下的交聯(lián)反應(yīng)也會(huì)降低固定化微生物的活性。因此,最佳交聯(lián)時(shí)間定為18~30h。2.3.4od400對(duì)微球降解性能的影響為確定固定化微球包埋的最佳種子菌濃(用OD600表示),設(shè)定海藻酸鈉濃度為3%,活性炭含量為0.5%,交聯(lián)時(shí)間為24h,其他條件同2.3.1節(jié),改變OD600,測(cè)定微球性能見(jiàn)圖5。由圖5可知,隨著OD600的增大,機(jī)械強(qiáng)度急劇減小,降解率先增后減。實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)OD600大于2.0時(shí),微球在降解過(guò)程中產(chǎn)生溶脹,致大量小球破碎,使實(shí)驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。這是由于微球內(nèi)菌濃過(guò)大時(shí),菌的過(guò)度增殖對(duì)海藻酸鈣凝膠有一定的破壞作用。降解率主要取決于吸附在微球表層的細(xì)菌數(shù)量,微球內(nèi)部的菌大部分處于休眠甚至死亡狀態(tài)。當(dāng)微球包埋菌濃過(guò)大時(shí),大量菌會(huì)由于空間狹小,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧的缺乏而死亡,致固定化微生物活性降低,降解率則會(huì)下降。因此,選擇OD600為1.0~2.0的種子菌濃較好。2.3.5固定化微球最佳包埋方案的確定為了優(yōu)化固定化微球的最佳制備條件,本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)SA濃度,包埋種子菌濃,交聯(lián)時(shí)間和活性炭含量進(jìn)行了優(yōu)化。基于本實(shí)驗(yàn)已得數(shù)據(jù),將SA濃度(因素A)設(shè)為3.0%、3.5%、4.0%,種子菌濃(用OD600表示)(因素B)設(shè)為1.0、1.5、2.0,交聯(lián)時(shí)間(因素C)設(shè)為18h、24h、30h,活性碳含量(因素D)設(shè)為0.5%、0.7%、1.0%。采用正交表L9(34)(表4)確定的由各因素不同水平組成的9組實(shí)驗(yàn)方案制備的固定化微球,以降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)安排實(shí)驗(yàn)。表4給出了各因素不同水平下的試驗(yàn)結(jié)果之和,并分別用K1、K2、K3表示,可判斷各因素均以水平2最佳。又根據(jù)表4中極差R值,可知各因素主次順序?yàn)?C(交聯(lián)時(shí)間)>B(種子菌濃)>A(SA濃度)>D(活性炭含量),說(shuō)明交聯(lián)時(shí)間和種子菌濃對(duì)微球活性的影響最為顯著。綜合考慮各因素,確定固定化微球最佳包埋方案是:A2B2C2D2。即:SA濃度為3.5%,活性炭含量0.7%,交聯(lián)時(shí)間為24h,種子菌濃(用OD600表示)為1.5,根據(jù)公式(1),種子菌濃為6×107cell/mL(對(duì)應(yīng)的微球包埋菌濃為6×106cell/mL)。由于表5中未列出此方案,后補(bǔ)做了實(shí)驗(yàn),由A2B2C2D2方案制得的固定化微球降解率為50.08%,機(jī)械強(qiáng)度為65.3mN,均優(yōu)于其他方案結(jié)果,此最佳方案得到驗(yàn)證。方差分析結(jié)果(表5)顯示,交聯(lián)時(shí)間和包埋菌濃對(duì)降解率影響最為關(guān)鍵,其它因素在此試驗(yàn)范圍內(nèi)沒(méi)有顯著差異,對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較小,與直觀分析結(jié)果(表4)相吻合。2.4接種量對(duì)固定化菌的降解的影響為了確定固定化Bbai-1降解原油的最佳條件,在25℃,0.2%的含油培養(yǎng)基中,分別改變固定化微球的接種量(用固定化微球與含油培養(yǎng)基的體積比表示)、pH和鹽度,以游離菌作對(duì)比,測(cè)定降解率(表7)。從表7中可知:(1)當(dāng)接種體積比小于0.15時(shí),降解率隨接種量增大而增大;大于0.15時(shí),降解率急劇下降;大于0.3時(shí),固定化微球在降解時(shí)大量破碎,使實(shí)驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行?？梢?jiàn),選擇體積比3:20(0.15)較好。這是由于接種量過(guò)小,即菌濃較低時(shí),降解率較低;但接種量并非越大越好,由于含油培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧是一定的,接種量過(guò)大,不僅會(huì)增加成本,由于傳質(zhì)性下降,還會(huì)使大部分固定化菌處于缺氧和貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),降解率也隨之下降。(2)游離Bbai-1菌的最適降解pH為7~8,最適降解鹽度為2.0%~2.5%,最大降解率