槐米中槲皮素提取工藝研究

槐米中槲皮素提取工藝研究

蝗蟲是豆科植物的一種干燥的花蕾。具有冷血止血、清肝瀉火的功效。用于各種血熱癥、肝炎、頭痛、紅眼等疾病的血液抑郁癥、頭痛和眼痛?；泵字饕J丁(rutin)、樺皮醇(betulin)、槐二醇(sophoradiol),以及槐花米甲、乙、丙素(sophorinA,B,C),還含有槲皮素(quercetin)、槐花皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ(kaikasaponinⅠ,Ⅱ,Ⅲ)等。蘆丁在酶或酸的作用下被水解成槲皮素?，F(xiàn)代藥理研究表明,槲皮素具有較好的祛痰、止咳作用,并具有一定的平喘作用,此外還具有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、調(diào)血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量等作用。文獻(xiàn)報(bào)道從槐米中提取蘆丁的方法,并且對(duì)不同的提取條件進(jìn)行了考察。而通過正交試驗(yàn)從槐米中直接提取槲皮素的方法均未見報(bào)道。本研究通過正交試驗(yàn)法考察了堿溶酸水解法提取槲皮素的主要影響因素,這對(duì)利用槐米中的槲皮素作為藥效成分的中藥制劑以及利用槐米來提取槲皮素具有一定的參考意義。1色譜藥物、藥品和相對(duì)生物日本島津LC-10Avp高效液相色譜儀,SPD-10Avp紫外可見光檢測器,CLASS-VPV5.03色譜數(shù)據(jù)處理工作站,BP211D十萬分之一電子天平(Sartorius,德國);槲皮素對(duì)照品(供含量測定用,0081-9904,中國藥品生物制品檢定所),槐米藥材購自四川省中藥材公司,經(jīng)鑒定為豆科植物槐S.japonicaL.的干燥花蕾;甲醇為色譜純,水為重蒸水,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1蘆丁、槲皮素的提取從槐米中提取槲皮素需先提取蘆丁,再經(jīng)水解后生成槲皮素。蘆丁的提取方法主要有堿溶酸沉淀法、有機(jī)溶劑提取法、浸漬法。其中以堿溶酸沉淀法最佳,生產(chǎn)上均采用該法。文獻(xiàn)選擇0.05%氫氧化鈉溶液煮沸20min,趁熱濾過,同法提取4次的工藝,得到蘆丁的堿水溶液,加酸使其析出,過濾后再加酸使其水解而得到不溶于水的槲皮素,濾過、水洗、干燥而得槲皮素固體。蘆丁的提取率直接影響槲皮素的產(chǎn)率,有文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁在pH2.0,3.5,6.0的溶液中提取率最大,而蘆丁的水解時(shí)間為90min最佳。經(jīng)試驗(yàn),影響蘆丁的提取率和槲皮素產(chǎn)率的主要因素是:蘆丁沉淀時(shí)的pH值、蘆丁水解時(shí)加入的酸量以及水解時(shí)間。結(jié)合文獻(xiàn)和預(yù)試結(jié)果,以上述3個(gè)主要因素為考察因素,每個(gè)因素設(shè)立3個(gè)水平(表1),采用L9(34)正交設(shè)計(jì),以槐米提取物中的槲皮素含量和提取率為指標(biāo),優(yōu)選槲皮素的制備工藝,試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。2.2流動(dòng)相、流動(dòng)相、柱溫度色譜柱為Shim-packCLC-ODS柱(6.0mm×150mm,5μm,日本島津),流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液(7∶3),流速為0.8mL/min,檢測波長為375nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為5μL。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算不低于4000。2.3對(duì)照溶液的制備精密稱取在105℃減壓干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品適量,加甲醇制成10μg/mL的溶液,即得。2.4沉淀物蘆丁的制備分別準(zhǔn)確稱取槐米20g,按表2安排試驗(yàn),加入已煮沸的10倍量0.05%氫氧化鈉溶液中,煮沸20min,趁熱濾過,同法提取4次,濾過,合并濾液,濾液用硫酸溶液(1→2)調(diào)節(jié)pH,靜置,過濾,抽干,得黃色沉淀物蘆丁,加適量的4%硫酸溶液微沸水解,靜置,冷卻,過濾,沉淀水洗,干燥,移置干燥器中放冷,稱定固體的質(zhì)量,每一試驗(yàn)重復(fù)3次。取上述固體約15.0mg,精密稱定,置50mL量瓶中,加甲醇約40mL,超聲10min使溶解,放至室溫,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。精密量取1mL置25mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。色譜圖見圖1。2.5蘆丁沉淀時(shí)ph值對(duì)提取率的影響見表2,3。從表2可知,以固體提取率為指標(biāo),最優(yōu)工藝為A1B1C1,說明蘆丁沉淀時(shí)的酸度越大、水解時(shí)的酸量越少、水解時(shí)間越短,固體提取率越大。以固體中槲皮素的含量為指標(biāo),最優(yōu)工藝為A3B3C1,說明蘆丁在酸度越小的溶液中沉淀時(shí),槲皮素的含量越高。若以槐米中槲皮素的提取率為指標(biāo),最優(yōu)工藝為A2B2C1。表3結(jié)果表明,蘆丁沉淀時(shí)的pH值對(duì)固體提取率和固體中槲皮素的含量影響的差異具有非常顯著性,而對(duì)槐米中槲皮素的提取率影響不明顯。水解時(shí)的酸量僅對(duì)固體中槲皮素的含量影響的差異具有顯著性,水解的時(shí)間對(duì)三者均不明顯。2.6槐米中槲皮素提取工藝的優(yōu)化通過正交試驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考慮固體中的槲皮素含量和槲皮素的提取率,選擇槐米中槲皮素提取的最優(yōu)工藝為A3B2C1。經(jīng)驗(yàn)證,固體的平均提取率為8.71%,固體中槲皮素的平均含量為79.61%,槲皮素的平均提取率為7.14%(n=5),說明上述工藝達(dá)到了優(yōu)化的目的。3堿提取蘆丁的酸液質(zhì)量及最佳發(fā)酵溫度的確定3.1供試品溶液的含量測定:取供試品溶液于375nm波長處測定,結(jié)果表明在上述色譜條件下,供試品中的雜質(zhì)峰很小,分離效果佳。3.2本實(shí)驗(yàn)選用煮沸的0.05%氫氧化鈉溶液提取蘆丁,不僅增強(qiáng)蘆丁的浸出效率,而且起到殺酶作用,減少蘆丁損失。經(jīng)測定,蘆丁提取液的pH值約為6,只須加少量的硫酸溶液就可調(diào)至酸性。3.3蘆丁經(jīng)堿溶酸沉后得到黃色的稠厚沉淀,需加入5倍生藥量的酸液才使之混懸,因此考察水解的酸量選擇8