核酸序列分析

第四章核酸序列分析核酸序列分析，亦稱核酸測序技術，簡稱測序。

1、基因層面的疾病確診；

2、發(fā)現(xiàn)潛在疾病的發(fā)病風險；

3、對個體化用藥提供指導；

4、指導生育健康的下一代；一、測序的意義

人類基因組計劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于2003年完成。人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工程，它奠定了21世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術產業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。造福人類的HGP1949年,FrederickSanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術,1953年測定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質的N端測序技術,后來在此基礎上發(fā)展出了蛋白質自動測序技術。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測定法,并完成了大腸桿菌5SrRNA的120個核苷酸的測定。同一時期,Holley完成了酵母丙氨酸轉運tRNA的序列測定。蛋白質和RNA的測序技術二、測序技術的建立1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測定DNA序列。1977年，

Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測定的效率和準確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報道了化學降解法測定DNA的序列。DNA測序技術的建立DNA序列測定技術出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質和RNA測序技術,成為現(xiàn)代分子生物學中最重要的技術。神奇的基因測序三、DNA測序技術的發(fā)展第一代DNA測序技術第二代DNA測序技術第三代DNA測序技術測序技術的發(fā)展雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)1970s同位素標記，手工1980s熒光標記，自動1990s毛細管電泳合成測序法（第二代測序）焦磷酸測序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）單分子測序技術（第三代測序）HelicosPacificBiosciences9

1994：3億美元測定一個人類基因組(1:10)1984：30億美元測定一個人類基因組2004：3千萬美元測定一個人類基因組(1:100)2006：1百50萬美元測定一個人類基因組(1:2000)2008：50萬美元測定一個人類基因組(1:6000)未來目標：1000/100美元測定一個人類基因組2011：5000美元測定一個人類基因組2014：上萬元測定一個人類基因組1、第一代DNA測序技術第一代DNA測序技術：傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法、化學降解法以及在它們的基礎上發(fā)展來的各種DNA測序技術。第一代DNA測序技術包括：雙脫氧鏈終止法、化學降解法、熒光自動測序技術。鏈終止法利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國劍橋分子生物學實驗室的生物化學家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。F.Sanger（1980年諾貝爾獎獲得者）（Thechainterminationmethod）與PCR反應類似。反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應過程：變性－復性－延伸－終止Sanger雙脫氧鏈終止法利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’-末端。因為ddNTP3’不是-OH，不能與下一個核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。雙脫氧鏈終止法基本原理：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子。雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖

鏈終止技術路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應產物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

如果測序反應產物被放射性標記：

通過放射自顯影膠片上的帶型，可直接讀出DNA上的核苷酸順序。

如果產物被一種熒光染料標記：

當他們通過電泳膠道時被激光照射而激發(fā)熒光時可被探測裝置搜集，由此得到的信號生成與DNA序列相對應的帶型或軌跡模式，從而實現(xiàn)DNA序列分析的自動化。凝膠電泳和序列讀取如果進行自動化分析可以一次性讀取1000bp序列DNA自動分析技術的測序反應體系主要包括：DNA模板

測序引物DNA聚合酶熒光標記熒光染料及熒光標記技術在DNA自動化測序中被廣泛應用。DNA模板：

1.單鏈DNA模板2.雙鏈DNA模板3.PCR產物DNA聚合酶：

1.大腸桿菌DNA聚合酶1大片段2.測序酶3.耐熱DNA聚合酶熒光標記方案：

1.染料標記引物2.染料標記終止物3.內部標記通過M13mp載體獲得單鏈DNA以測序M13mp噬菌體載體是專為得到單鏈DNA測序模板而設計的。Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應用。后來在此基礎上發(fā)展出多種DNA測序技術，其中最重要的是熒光自動測序技術。熒光自動測序技術熒光自動測序技術基于Sanger原理，用熒光標記代替同位素標記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術的DNA測序儀。

如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標記，在通過毛細管時不同長度的DNA片段上的4種熒光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCD檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNA序列。目前所用自動測序技術的改進3730

全自動測序儀用不同的熒光色彩標記ddNTP,如ddATP標記紅色熒光,ddTTP標記綠色熒光,ddCTP標記藍色熒光,ddGTP標記黃色熒光,由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.產物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信號，由計算機判讀并記錄。第一代全自動測序

——毛細管電泳測序用毛細管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，可使DNA的測序速度更為迅速。這種電泳裝置有96個泳道，每次可同時進行96次測序，每輪實驗不到2小時，1天可完成近千次反應。自動DNA測序儀的主要構成：1.測序反應系統(tǒng)2.電泳系統(tǒng)3.熒光檢測系統(tǒng)4.電腦分析系統(tǒng)

自動DNA測序儀的種類：

第一類采用“單染料/四泳道”第二類采用“四染料/單泳道”

測序策略

定義：測定未知DNA序列的方案，

即應該通過具有最小重疊、最少數(shù)量的測序反應，能拼接成目的DNA正確的序列。對于一個待測DNA分子，要制定一個能夠簡捷準確的測定方案，應考慮：1.DNA片段大小2.背景資料3.測序目的4.實驗條件測序策略確證性測序策略：對已知序列的次級克隆或PCR產物進行鑒定和證實。未知DNA序列的測定策略對于較小的目的DNA片段（如小于1KB）,可以直接利用M13mp或質粒系統(tǒng)克隆、測序。對于數(shù)千個堿基的大片段未知序列DNA，乃至數(shù)億個堿基的生物基因組，必須將其切割成適當大小的各個片段（如小于1KB）分別進行次級克隆再進行測序，最后拼接全序列。2、第二代DNA測序技術新一代測序技術也稱第二代測序技術，使用接頭進行高通量的并行PCR和并行測序反應，并結合微流體技術，利用高性能的計算機對大規(guī)模的測序數(shù)據(jù)進行拼接和分析。

商品化的測序平臺主要有：羅氏/454公司的GSFLX測序平臺、Illumina公司的GenomeAnalyzer測序平臺ABI公司的SOL2iD測序平臺。基本原理：

先進行文庫制備，即將片段化的基因組DNA兩側連上通用接頭；隨后運用PCR技術擴增技術來產生幾百萬個空間固定的DNA簇，這種DNA簇由單個文庫片段的多個拷貝組成，稱PCR克隆陳列或（稱聚合酶克?。詈筮M行測序，即測定每個克隆的核苷酸序列。

這些反應能大規(guī)模的同時進行，然后對每一步反應所產生的信號進行同時檢測，以此來獲取測序的數(shù)據(jù)，經(jīng)過計算機分析獲得完整的DNA序列信息，能實現(xiàn)一次對幾百萬條DNA分子進行序列測定。工作流程：

文庫制備DNA簇的產生測序邊合成邊測序

焦磷酸測序技術

連接測序第二代測序技術不需要進行DNA模板克隆。第二代測序技術最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序,使得對一個物種的轉錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。第二代測序技術最大的優(yōu)勢在于其測序通量的持續(xù)增長，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。第二代測序技術并不完美，由于其在測序前要通過PCR手段對待測片段進行擴增，因此增加了測序的錯誤率。并且其測序結果比較短，更適合重測序，而不太適用于沒有基因組序列的全新測序。第二代測序技術的應用1.從頭測序、重測序和個體基因組測序2.個體基因組測序和SNP研究3.轉錄組及表達譜分析4.小分子RNA研究3、第三代DNA測序技術

最近,以單分子DNA進行非PCR的測序為主要特征的第三代DNA測序技術已經(jīng)出現(xiàn),

如生物科學公司(BioScienceCorporation)的HeliScope單分子測序儀。第三代測序技術的目標是：

實現(xiàn)人全基因組3分鐘的測序時間及5000美元的測序價格。高通量單分子測序原理第三代測序技術獲重大進展基因測序亂象多思考題1.第一代DNA測序技術的核心技術A.Sanger的雙脫氧鏈終止法B.Maxam和Gilbert的化學降解法C.熒光標記技術D.PCR技術E.DNA自動分析技術2.Sanger雙脫氧鏈終止法使用的鏈終止物A.NTPB.dNTPC.ddNTPD.a-32P-dNTPE.a-35S-dNTP3.不適宜于直接作為第一代測序技術測序的DNA模板A.雙鏈DNA片段和PCR產物B.單鏈DNA片段C.克隆于質粒載體的DNA片段D.克隆于真核載體的DNA片段E.提取的染色質DNA4.DNA自動化測序技術一般不用到的技術A.Sanger的雙脫氧鏈終止法

B.Maxam和Gilbert的化學降解法C.熒光標記技術D.PCR技術E.電泳技術5.不是自動DNA測序儀的主要系統(tǒng)之一A.測序反應系統(tǒng)B.電泳系統(tǒng)C.熒光檢測系統(tǒng)D.探針熒光標記系統(tǒng)E.電腦分析系統(tǒng)6.要制定一個能夠簡捷準確的DNA測定方案，一般應考慮A.DNA片段的大小B.背景資料C.實驗條件D.測序目的E.以上都是7.第二代測序技術一般不用到A.雙脫氧鏈終止法B.文庫接頭C.高通量的并行PC