杠柳毒苷在模擬人體消化道液中的穩(wěn)定性研究

杠柳毒苷在模擬人體消化道液中的穩(wěn)定性研究

甘氨酸是中藥科加皮科的主要強(qiáng)心成分。它的結(jié)構(gòu)成本包括甘氨酸d-（加拿大麻糖）-d-（葡萄糖）?，F(xiàn)代藥理研究表明,杠柳毒苷強(qiáng)心作用具有速度快,持續(xù)時(shí)間短,無(wú)蓄積作用等特點(diǎn)。目前香加皮作為傳統(tǒng)中藥多用于治療心力衰竭的復(fù)方中,以口服方式給藥,國(guó)內(nèi)外對(duì)其在機(jī)體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化尚無(wú)研究。對(duì)于口服給藥方式,藥物在消化道內(nèi)的穩(wěn)定性是其在機(jī)體內(nèi)吸收、代謝和起效的一個(gè)重要環(huán)節(jié),因此筆者對(duì)杠柳毒苷在體外模擬消化液中的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行考察,以便進(jìn)一步對(duì)其體內(nèi)代謝進(jìn)行研究,為指導(dǎo)合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1液相色譜及質(zhì)譜Waters515高效液相色譜系統(tǒng),Waters2487紫外檢測(cè)器;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng):HP1100高效液相色譜系統(tǒng)(配二極管陣列檢測(cè)器)、Finnigan離子阱質(zhì)譜儀(LCQAdvantageMax,USA,ESI離子源);AX205分析天平、DELTA320pH計(jì),恒溫水浴、臺(tái)式離心機(jī);杠柳毒苷對(duì)照品(本所自制),胃蛋白酶和胰蛋白酶(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司),乙腈(色譜純),超純水,其他試劑為分析純。1.2測(cè)量條件1.2.1色譜柱及色譜條件AgilentZorbaxC18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA),流動(dòng)相為乙腈∶水(29∶71),流速為1mL/min,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。1.2.2液質(zhì)條件AgilentZorbaxC18色譜柱(2.1mm×150mm,5μm,Agilent,USA),流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60),流速為0.2mL/min,柱溫為25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。質(zhì)譜參數(shù):噴霧電壓4.5kV,毛細(xì)管溫度300℃,毛細(xì)管電壓37V,殼氣流速40arb,輔助氣流速5arb,正離子模式,MS監(jiān)測(cè)m/z=190~900總離子流信號(hào),MS/MS模式,碰撞能量20%,監(jiān)測(cè)m/z=100~900總離子流信號(hào)。1.3含量測(cè)定的方法與文本研究1.3.1最大劑量設(shè)計(jì)目標(biāo)精密稱(chēng)取10mg杠柳毒苷對(duì)照品,置于100mL容量瓶中,用水溶解定容至刻度,搖勻,即得杠柳毒對(duì)照品貯備液,濃度為0.10mg/L。精密吸取杠柳毒苷對(duì)照品貯備液適量,用水配制成濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20mg/L的杠柳毒苷對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10μL,每個(gè)濃度平行操作3份,以峰面積(Y)平均值為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)作圖,得回歸方程為Y=1.47×104X-8.20×102,r=0.9999,線性范圍為0.002~0.2μg。1.3.2低、中、濃度杠柳毒苷峰面積rsd精密吸取杠柳毒苷對(duì)照品貯備液適量,用水配制成濃度分別為0.6、3、15mg/L的杠柳毒苷對(duì)照品溶液,每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)得低、中、高濃度杠柳毒苷峰面積(RSD)分別為2.9%、1.9%、1.7%。1.3.3模擬藥樣的檢測(cè)考察與模擬胃液離子強(qiáng)度相當(dāng)?shù)娜芤汉湍M小腸液中測(cè)定的準(zhǔn)確度。精密吸取杠柳毒苷對(duì)照品貯備液適量,分別用與模擬胃液離子強(qiáng)度相當(dāng)?shù)娜芤篬0.05mol/L氯化鈉(NaCl)溶液]和模擬小腸液(pH=6.8磷酸鹽緩沖液)配制成濃度分別為0.6、3、15mg/L杠柳毒苷對(duì)照品溶液,進(jìn)樣10μL,將測(cè)得的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得杠柳毒苷的含量,每個(gè)濃度平行操作5份。測(cè)得模擬胃液低、中、高濃度杠柳毒苷的回收率分別為103.4%、102.7%、101.3%,RSD分別為1.3%、1.9%、1.6%;模擬腸液低、中、高濃度杠柳毒苷的回收率分別為100.5%、101.9%、102.8%,RSD分別為2.7%、2.2%、0.9%。1.4模擬消化液穩(wěn)定性研究1.4.1模擬條件和模擬方法胃液的主要成分是胃酸(鹽酸),空腹時(shí)胃液的pH值為0.9~1.5,飲水或進(jìn)食后pH值可上升為3.0~5.0;小腸液的pH值為5.0~7.4,大腸液的pH值為8.0~9.0。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版,配制模擬空腹胃液和模擬小腸液,在此基礎(chǔ)上采用碳酸鈉(Na2CO3)溶液和氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH值配制模擬進(jìn)食胃液和大腸液。每100mL模擬空腹胃液加1g胃蛋白酶,每100mL模擬小腸液加1g胰蛋白酶,作為含酶模擬消化液。配制的6種模擬消化液包括:空腹胃液(含酶、無(wú)酶)pH值為1.2,進(jìn)食胃液(無(wú)酶)pH值為4.9,小腸液(含酶、無(wú)酶)pH值為6.8,大腸液(無(wú)酶)pH值為8.7。1.4.2模擬消化液配制精密吸取杠柳毒苷對(duì)照品貯備液0.3mL,分別用以上6種模擬消化液稀釋至2mL,渦旋混勻,樣品溶液濃度為含杠柳毒苷15mg/L。1.4.3樣品含量測(cè)定將1.4.2項(xiàng)下的每種消化液樣品分別分裝至6支具塞試管中放置于37℃水浴中,于0、0.5、1、1.5、2、4、6h取樣進(jìn)行含量測(cè)定,含酶的樣品用乙腈稀釋1倍后4000r/min離心5min取上清液測(cè)定,進(jìn)樣量10μL,實(shí)驗(yàn)在不同天重復(fù)3次。2結(jié)果2.1酶活性測(cè)定結(jié)果杠柳毒苷在不同模擬消化液中的穩(wěn)定性有所差異,在空腹胃液中隨時(shí)間含量逐漸降低,1h含量降低22.3%,6h降低79.4%,在色譜圖中約在10.9min處有一新峰產(chǎn)生,見(jiàn)圖1。在無(wú)酶的空腹胃液、進(jìn)食胃液、小腸液、大腸液中0~6h含量無(wú)變化,結(jié)果見(jiàn)表1。另外,分別對(duì)無(wú)酶和含酶的空腹胃液見(jiàn)圖2、小腸液見(jiàn)圖3進(jìn)行比較,結(jié)果說(shuō)明加入胃蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)其含量變化沒(méi)有明顯影響。2.2esi-ms質(zhì)譜特性對(duì)杠柳毒苷在模擬空腹胃液中出現(xiàn)的水解產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。該物質(zhì)經(jīng)薄層板分析用3,5-二硝基苯甲酸和NaOH交替顯色后呈紫紅色,證明其可能有強(qiáng)心苷母核;對(duì)其進(jìn)行ESI-MS一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析,正離子模式全譜中顯最強(qiáng)峰m/z391,符合杠柳苷元[M+H]+離子,見(jiàn)圖4。以20%的能量對(duì)該離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,得到了m/z373、355、337碎片離子,見(jiàn)圖5,應(yīng)是杠柳苷元上3個(gè)羥基連續(xù)脫去一分子水(H2O)得到。說(shuō)明杠柳毒苷在模擬空腹胃液出現(xiàn)的這一新物質(zhì)為杠柳苷元。3不同的d-加拿大麻糖和d-葡萄糖的杠柳苷元在消化液環(huán)境下的穩(wěn)定性模擬消化液的pH值是影響杠柳毒苷穩(wěn)定性的重要因素。杠柳毒苷在pH=1.2的模擬空腹胃液環(huán)境中不穩(wěn)定,水解產(chǎn)物為脫去糖基部分(D-加拿大麻糖和D-葡萄糖)的杠柳苷元,在其他模擬消化液環(huán)境中6h內(nèi)穩(wěn)定。這主要是由于糖