電針刺激對延髓背柱核神經(jīng)元激活效應的影響

電針刺激對延髓背柱核神經(jīng)元激活效應的影響

“靈樞九針十二原”說，“五臟有疾病，必須有十二原?！?。”這說明臟腑有病可在體表一定部位出現(xiàn)病理反應。阿是穴也是患病時出現(xiàn)在體表的一種病理性反應點。我們以往的一些研究也證實有些背根神經(jīng)有分支分別分布于心臟和相當于中醫(yī)心經(jīng)的體表區(qū)域。我們對內臟病理狀態(tài)下穴位敏感程度的變化進行研究,觀察電針刺激對延髓背柱核(DCN)神經(jīng)元激活效應在正常和內臟傷害性傳入情況下反應的量-效變化,以探討穴位敏化的中樞機制。1穴位刺激與內臟傷害性傳導的作用實驗采用神經(jīng)示蹤法標識大鼠前肢內側面(心經(jīng)經(jīng)脈循行線)與心臟的神經(jīng)聯(lián)系,表明C8-T3脊神經(jīng)節(jié)的少量(6.8%)細胞的外周軸突有雙分支現(xiàn)象,其一支分布于心臟,另一支分布于上肢內側。同樣,在貓左前肢“天泉”穴區(qū)處和左側星狀神經(jīng)節(jié)及左心下神經(jīng)注入熒光標記物,背根節(jié)中也可見到少量(8%)雙標的細胞,主要分布于C6~T2節(jié)段之間,其中尤以C8和T1節(jié)段最多。然而這種軸突分支的現(xiàn)象畢竟為數(shù)不多,并不能完全解釋復雜的體表內臟之間的相互作用?，F(xiàn)代研究也表明內臟的信號能影響相對應的軀體,Jou等向大鼠心包內注射一種海藻類化合物可引起脊髓兩側肌肉的痙攣樣收縮,切斷左側交感鏈和雙側迷走神經(jīng)可分別減弱和加強這種肌電反應。他們認為,心絞痛牽涉痛的發(fā)生除軀體和內臟的傳入在脊丘神經(jīng)元上匯聚外,刺激心交感所誘發(fā)的痙攣樣肌肉收縮引起的繼發(fā)性疼痛也是一個因素。我們在實驗中刺激大鼠心交感神經(jīng)可引起心經(jīng)穴位的最大反射性肌電反應,與肺經(jīng)穴位相比有明顯差異。同樣,電刺激貓左心下神經(jīng)后,“曲澤”及“天泉”等心包經(jīng)穴區(qū)肌電活動明顯增加;而肺經(jīng)上的穴位如“孔最”“尺澤”及“天府”穴區(qū)的肌電變化不明顯。電刺激心下神經(jīng)在心包經(jīng)穴位上誘發(fā)出肌電所需的刺激閾值低于肺經(jīng)穴位。電刺激心下神經(jīng)亦可明顯增加“天泉”穴區(qū)皮神經(jīng)的放電活動。左冠狀動脈前降支結扎造成急性心肌缺血后可降低刺激的閾值。依次切斷T1~C7的背根和腹根后,刺激閾值逐步提高。內臟病理情況下出現(xiàn)的對臟器本身的傷害性刺激重要特征之一是其疼痛常反射到遠隔損傷部位的某些體表區(qū)域,這種牽涉性疼痛常表現(xiàn)為尖銳、清晰和定位清楚,并常伴有痛覺過敏(觸發(fā)點)或以對觸覺刺激的反應性增高和痛閾降低為特征的繼發(fā)性痛覺過敏,而不同于真性內臟痛所具有的深、鈍、模糊和定位不明確等特征。盡管觸發(fā)點大多位于牽涉痛的區(qū)域,但有些卻離開牽涉痛部位一些距離。針灸刺激這些敏感點可以產生很好的鎮(zhèn)痛效果。盡管牽涉痛的某些特征可用外周機制以及皮膚和內臟的傳入在脊髓中的會聚和相互作用來解釋,但痛覺過敏的機制尚不明了。因為脊丘束傳統(tǒng)上被視為傷害性傳入的主要通路,以往的許多疼痛研究中觀察到該通路的傷害性傳入可以被另外一個傷害性刺激的傳入所抑制。然而,最近的研究發(fā)現(xiàn),背柱-內側丘系在內臟傷害性信息傳遞過程中也發(fā)揮一定的作用,因而可以認為輕觸的傳入刺激與內臟傷害性傳入可以被條件性觸覺刺激發(fā)生以抑制為主的調控反應。延髓背柱核(DCN)神經(jīng)元傳統(tǒng)上被認為是軀體傳入的高級中樞。近些年來的研究工作表明它在傳遞內臟傷害性傳入信息到丘腦和皮層等高級中樞中起重要作用,這就為軀體與內臟傳入信號會聚發(fā)生在DCN水平提供了結構上的基礎。盡管有極少的解剖和生理學報道DCN接受內臟的傳入,DCN傳統(tǒng)上被認為是延髓的主要感覺中樞。但近些年來,越來越多的文獻報道支持這樣一種假說:DCN在內臟傷害性傳入到高級神經(jīng)中樞如丘腦和皮層過程中起到特有的作用。在本項研究中,我們將系統(tǒng)觀察內臟刺激對延髓DCN神經(jīng)元傷害性信息傳遞過程的影響,探討內臟傷害性傳入對體表穴區(qū)感覺過敏現(xiàn)象的發(fā)生與發(fā)展過程,研究體表穴位與內臟相關聯(lián)系的生物學基礎,探討穴位敏化的生物學機制。2方法2.1體重、清潔級實驗選用健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠23只,體重250~300g,清潔級。由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。動物實驗前禁食12h,不禁水,實驗過程中對動物的處置遵循2006年科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。2.2向外推移植物質地膜下小鼠骨膜過血取定kopf-400大鼠用烏拉坦(urethane,1.0~1.2g/kg)腹腔注射麻醉。外科手術在麻醉情況下進行。將動物仰臥在手術臺上,于頸正中線切開皮膚,分離氣管。在暴露的氣管中下端順氣管軟骨環(huán)作一橫切口,插入氣管導管,后用絲線結扎固定,以保持呼吸道通暢。然后分離頸總動脈和分離頸靜脈,靜脈插管用于輸液,動脈插管用于監(jiān)控實驗過程中的血壓變化。為了使大鼠延髓能充分暴露,將大鼠雙耳用耳棒固定于KOPF-900型立體定位儀上,于顱正中切開皮膚、皮下組織,去除骨膜;將鼠頭向下屈曲60度~70度,用操縱桿垂直頂住顱骨,使大鼠頭部處于屈曲狀態(tài),然而用牙托水泥將顱骨與操縱桿粘合在一起,保持鼠頭位置穩(wěn)定。沿項部中央切開皮膚,分離并剪除皮下筋膜和肌肉,然后用棉球鈍性向下推除深部結締組織,充分暴露枕骨大孔。用一次性8號注射針頭的尖端斜面沿枕骨大孔將硬脊膜作環(huán)性切割,暴露出菱形窩,在顯微鏡下用游絲鑷撕開軟腦膜。手術完成后用剪開的皮瓣縫合成皮槽,暫用38℃左右的石臘油覆蓋,以避免延髓干燥。在正式實驗時插入記錄微電極后皮槽中灌注2%的瓊脂,以保護延髓、避免干燥和減少因呼吸產生的延髓振動。2.3細胞放電試驗DCN(薄束核)神經(jīng)元記錄的座標為:延髓菱形窩底端(obex)開始,沿菱形窩邊緣向上約0~3.0mm范圍內,旁開約1.5~2.0mm,延髓表面下100~500μm(見圖1)。單細胞活動的細胞外記錄采用充灌2%Pontamineskyblue的0.1M醋酸鈉的玻璃微電極(尖端約5μm,阻抗約10~15MΩ),在微電極操縱器控制下根據(jù)DCN的座標將記錄微電極插入核團,尋找所需的神經(jīng)元。細胞放電經(jīng)微電極引入Spikes-2(Oxford)或Power-Lab電生理儀系統(tǒng),進行細胞放電的放大和信號處理。所記錄到的神經(jīng)元都檢查其外周感受野對機械刺激(包括觸刺激、vonFrey毛反應敏感度、齒鑷夾皮刺激)、手針刺激,觀察它們的感受野分布范圍、感受野大小,量化反應的性質及反應的強度。隨后也試驗這些神經(jīng)元對直結腸擴張(ColorectalDistension,CRD)刺激的反應。只有對皮膚和CRD刺激都發(fā)生反應的神經(jīng)元才列入研究對象以確定這兩種分別來自體表和內臟傳入能否發(fā)生相互作用。2.4不同大小血清中mmlphp的crd方法內臟傷害性刺激采用直結腸擴張法,將一長約4~6cm的氣囊經(jīng)肛門插入直結腸,插入的深度約為5~6cm,為避免造成腸壁損傷與肛門刺激,置入時在氣囊上涂抹潤滑油。內臟傷害性傳入由插入直腸內的氣囊充氣超過20~30s造成CRD,試驗的直結腸壓力一般控制在20~80mmHg之間,≥40mmHg為傷害性;超過100mmHg易造成直結腸破裂。氣囊用乳膠指套或安全套制作而成,捆綁在一外徑約為4mm的膠管上。如采用乳膠指套則需在實驗前充氣并留置過夜以克服氣囊壁的張力。手動氣囊通過T型管與壓力換能器相連接。CRD由通過血壓計輸出20~80mmHg、持續(xù)20s或更長時間的壓力充盈氣囊來實現(xiàn)。為避免出現(xiàn)過度刺激以及結直腸可能的敏感化,重復CRD刺激應為間隔10min以上。選擇引起Aδ纖維反射閾值強度1.5倍的電針刺激“足三里-上巨虛”穴區(qū)[具體方法參考我們以前的工作,平均引起Aδ纖維反射閾值強度為(1.76±0.62)mA],然后給予20、40、60、80mmHg的CRD,觀察從非傷害性(20mmHg)、傷害性(40mmHg)、到強傷害性(60-80mmHg)內臟刺激時穴位刺激引發(fā)該神經(jīng)元敏化反應的量效關系。采用的標準條件性刺激的程序的設定是先記錄的神經(jīng)元背景活動,然后給予30s的CRD刺激,停止CRD后立即給予30s感受野的手針刺激,觀察CRD前后針刺引發(fā)該神經(jīng)元激活反應的變化。2.5玻璃微電極的制備用Power-Lab計算機數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、Chart5.0分析軟件和SPSS13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理分析,計算神經(jīng)元每秒的放電個數(shù)和激活/抑制率,將干預前后的均值和差值做描述性統(tǒng)計(Descriptives)。組間比較采用配對t檢驗。單細胞記錄程序結束后,用刺激器連通隔離器經(jīng)微電極放大器向玻璃微電極通以20μA的負向直流電20~30min,將玻璃微電極內的滂胺天藍導入DCN以標記電極記錄位置。隨后將動物處死,用4%的多聚甲醛做心臟灌流后取腦干,4%多聚甲醛固定,兩天后取組織做冰凍切片和HE染色觀察,參考大鼠腦圖譜(Paxinos及Watson,2007),確定記錄點的位置。2.6平均動脈血壓的維持整個實驗過程中,動物體溫通過一反饋型加熱儀控制和維持在36~38℃之間。在監(jiān)控動脈血壓的實驗中,平均動脈壓都可維持在正常范圍;但在條件化刺激過程中血壓有一過性小幅度的、以升壓為主的變化反應。3結果3.1神經(jīng)元對肢體刺激、內臟傷害性感染的感受野實驗用23只SD雄性大鼠,記錄的神經(jīng)元均位于DCN的楔束核(接受來自下胸節(jié)以下的傳入)。因只有部分DCN神經(jīng)元接受廣泛的軀體和內臟傳入,在記錄的124個對軀體感受野觸覺刺激發(fā)生反應的DCN神經(jīng)元中,僅27個能對CRD發(fā)生反應,其中21個被興奮,6個被抑制。本項研究所記錄的DCN神經(jīng)元對軀體刺激與內臟傷害性刺激的感受野基本位于下肢(圖2),與我們以往的報告相同。少數(shù)神經(jīng)元感受野非常大,而另一些則非常小,僅呈點分布。部分DCN神經(jīng)元有一定的自發(fā)性背景活動,但多為散在性或小簇狀放電,自發(fā)放電的頻率并不很高(3.42±0.86)峰電位/s;也有一些神經(jīng)元缺乏背景放電,需給予不斷地外周刺激才能尋找到神經(jīng)元。神經(jīng)元對刺激反應的閾值差別較大。與軀體刺激相比,僅有約9%的DCN神經(jīng)元對內臟傷害性傳入(CRD)發(fā)生反應;而且,神經(jīng)元對CRD的反應明顯弱于對觸覺刺激產生的反應。3.2量效關系與神經(jīng)元自適應的關系在9個DCN神經(jīng)元系統(tǒng)觀察了分級的CRD刺激引起的反應,在20~80mmHg范圍內,隨著內臟擴張壓力的升高,神經(jīng)元反應的強度也隨之增加,呈現(xiàn)出一定線性的量-效關系(參見圖3)。但這種量效關系遠遠低于我們在脊髓觀察到的結果,這種結果表明DCN神經(jīng)元對內臟感覺的分辨功能有限。在CRD刺激達到60~80mmHg時,DCN神經(jīng)元細胞的放電數(shù)基本呈現(xiàn)平臺趨勢。3.3損傷強度crd對穴位敏化的影響為了研究內臟傷害性傳入對穴位敏化的影響,我們采用的標準條件性刺激的程序的設定是首先觀察外周興奮性感受野位于穴位電針刺激引發(fā)的DCN神經(jīng)元激活反應,單純給予大鼠20~80mmHg的強度CRD刺激對該神經(jīng)元引發(fā)的激活反應,然后觀察CRD刺激30s,之后停止CRD刺激,緊跟著給予30s的1.5倍Aδ纖維閾值的穴位電針檢驗刺激引發(fā)的激活反應強度的變化,以此在DCN水平研究內臟傷害性刺激誘發(fā)的穴位敏化反應和相關機制。本實驗電針部位選擇外周感受野位于同側“足三里-上巨虛”穴區(qū)的DCN神經(jīng)元,亦即該神經(jīng)元分別對CRD和針刺足三里-上巨虛穴區(qū)都發(fā)生激活反應。實驗觀察到持續(xù)30s的20~80mmHg的CRD刺激對延髓DCN神經(jīng)元有隨著CRD量的增加逐漸出現(xiàn)明顯的激活作用。在CRD刺激后給予單純電針刺激,DCN神經(jīng)元對電針的激活反應明顯增強(參見表1和圖4),表明在給予大鼠持續(xù)的傷害性CRD刺激造成內臟傷害性損傷后,腧穴的效應發(fā)生了敏化,這種穴位的敏化反應與內臟傷害性強度成正比。(分別為20、40、60和80mmHg)。注:每一組圖片的上部分為神經(jīng)元的放電圖,下部分為直方圖;左側為CRD前電針反應,右側為CRD后針刺引發(fā)同一個神經(jīng)元的敏化反應。在14個DCN神經(jīng)元觀察了20mmHgCRD時1.5倍Aδ纖維激活強度電針刺激引起的激活反應,如圖4所示:在20mmHg強度的CRD前,電針刺激對DCN神經(jīng)元有明顯的激活作用,和背景活動相比,電針引起的神經(jīng)元的激活百分比增加了(119.74±14.57)%,結果顯示有統(tǒng)計學意義(P<0.001);而給予CRD刺激后,電針對DCN神經(jīng)元產生的激活反應有所升高,為CRD前電針激活效應的(119.45±12.84)%,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在13個DCN神經(jīng)元觀察了40mmHg微傷害強度CRD時同等強度電針刺激引起的激活反應,電針引起的神經(jīng)元的激活反應在CRD后增加了(21.52±4.89)%,統(tǒng)計學結果顯示有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而在60和80mmHg傷害強度的CRD后,電針激活DCN神經(jīng)元的程度分別增加了(29.51±5.78)%和(32.07±6.32)%,都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在20~80mmHg強度的CRD之間,同強度電針對DCN神經(jīng)元激活反應的易化作用隨著內臟擴張的傷害性強度的增加而增加,呈現(xiàn)一定的量效線性關系(見圖5)。這些結果表明:傷害性內臟擴張刺激可以敏化延髓的DCN神經(jīng)元,使其對穴位的電針傳入產生更強烈的反應,DCN神經(jīng)元在內臟傷害性損傷后功能易化導致了穴位敏化的動態(tài)變化;而且,隨著內臟傷害性刺激的強度加大,對穴位的敏化作用進一步加強,呈現(xiàn)出一定的量效敏化關系。這些結果表明延髓DCN參與了腧穴敏化的動態(tài)變化過程。4穴位針刺對dcn神經(jīng)元c背柱核(DCN)神經(jīng)元傳統(tǒng)上被認為是軀體傳入的高級中樞。由脊髓背柱的上行粗大纖維組成內側的薄束和外側的楔束,薄束由來自T6以下節(jié)段的纖維組成,楔束由來自T6以上節(jié)段的纖維組成。薄束和楔束上行到達延髓背側面分別終止于薄束核和楔束核。二者合稱后索核,又稱延髓背柱核(DorsalColumnNuclei,DCN)。一般認為,DCN主要接受來自脊神經(jīng)節(jié)的一級傳入纖維,但也接受來自脊髓背角的二級傳入纖維。從DCN發(fā)出的有髓纖維繞經(jīng)中央管在其腹側交叉,交叉后的纖維折向上行,組成內側丘系,其纖維上達丘腦和大腦皮層。DCN神經(jīng)元對來自皮膚、關節(jié)以及肌肉感受器的沖動發(fā)生反應。早在上個世紀50年代,Aidar等在貓的薄束核記錄到刺激內臟大神經(jīng)誘發(fā)的反應。Rigamonti和Hancock同樣在貓的薄束核記錄到刺激內臟神經(jīng)引起的場電位反應和單個神經(jīng)元的激活。解剖學的研究表明,薄束核接受來自內臟大神經(jīng)的初級傳入和接受來自腰髓的非初級傳入。皮膚震動的條件刺激不但可使DCN神經(jīng)元放電增加,在停止皮膚震動的條件刺激的即刻給予CRD作為檢驗刺激,CRD的反應則反而有所抑制,雖然抑制率僅為13%左右。反過來,先給CRD作為條件刺激(也可引起DCN神經(jīng)元放電增加),在停止CRD的即刻給予皮膚震動的檢驗刺激卻可以易化神經(jīng)元的反應,這種結果表明內臟痛時出現(xiàn)的體表相應神經(jīng)節(jié)段的反應過敏及牽涉痛有關,也與中醫(yī)針灸的阿是穴出現(xiàn)相關。在觀察的20個DCN神經(jīng)元中,非感受野區(qū)穴位針刺刺對DCN神經(jīng)元CRD反應的抑制率為23%。這些結果表明,在DCN水平,針刺對CRD引起這類神經(jīng)元的興奮反應有一定程度的抑制作用,統(tǒng)計學處理的結果表明具有統(tǒng)計學意義。可以認為,DCN在感受內臟傷害性反應的過程中,受到來自體表針刺的較弱而有效的抑制作用。Willis研究組開始的實驗是確定是否存在經(jīng)背柱的內臟傷害感受的通路,他們采用記錄丘腦腹后外側核(VPL)單細胞活動的電生理學方法,直-結腸擴張(CRD)以及結腸炎癥化可激活VPL神經(jīng)元;這些神經(jīng)元同時也對皮膚的機械刺激發(fā)生反應。隨后切斷背柱發(fā)現(xiàn)可降低VPL神經(jīng)元60%~80%對CRD的反應,而切斷脊-丘束的前外側柱僅減少VPL神經(jīng)元20%對CRD的反應。背柱切斷還明顯減少皮膚弱刺激引起的VPL神經(jīng)元激活反應,但對傷害性機械刺激反應影響較小;而切斷脊-丘束的前外側柱幾乎完全阻斷了皮膚傷害性機械刺激引起的VPL神經(jīng)元激活反應,但對非傷害性皮膚刺激反應影響較小。切斷背柱也減小結腸炎癥刺激而引起的VPL神經(jīng)元的敏化反應,而切斷脊-丘束的前外側柱則影響較小;用電解法或用海人酸損毀薄束核也減少CRD激活的VPL神經(jīng)元激活反應。這些工作表明在向VPL傳導直-結腸傷害性信息方面,背柱通路比脊-丘束通路更為重要。Berkley和Hubscher報告約有50%的DCN神經(jīng)元既對輕柔的皮膚刺激也對子宮和陰道的擴張刺激發(fā)生激活反應。Al-Chaer等在DCN單細胞記錄的實撿中發(fā)現(xiàn)能被丘腦腹后外側核和內側丘系逆向刺激激活的神經(jīng)元也對皮膚和直-結腸的機械和化學刺激發(fā)生反應。他們認為,DCN中來自皮膚的傳入主要是初級感覺傳入,而來自