Chemotherapeutic leukopenia標志物的初步分析及中藥復方預防方案的Meta分析

題目：Chemotherapeuticleukopenia標志物初步分析及中藥復方預防方案的Meta分析目錄摘要 前言結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年提升。目前臨床常見治療結直腸癌方法包括外科手術治療、輔助化療、新輔助化療、精準治療等ADDINNE.Ref.{B494090B-CEDD-4DD5-81A5-4CC935A0D0ED}[1]。其中化療是最常見的治療手段，5-氟尿嘧啶類化療藥物是治療結直腸癌的一線化療用藥?？ㄅ嗨麨I在體內經過三步代謝機制轉化為有活性的5-氟尿嘧啶，與其它化療藥物相比，具有口服用藥方便、療效好、不良反應輕的特點ADDINNE.Ref.{6701AD1B-6127-47C9-8D4C-E4B4AA5F2F68}[2]。5-氟尿嘧啶經過進一步體內代謝生成5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸和5-氟尿嘧啶核苷進而發(fā)揮抗腫瘤作用。但是這些代謝產物可以通過偽代謝物的形式摻入到正常細胞DNA和RNA中，產生細胞毒性，從而導致不良反應的發(fā)生ADDINNE.Ref.{74A36BC8-98FA-46F4-B42B-D9CD51D6805D}[3]。骨髓抑制是使用5-氟尿嘧啶類化療方案可能引起的常見不良反應之一，表現(xiàn)為貧血、血小板或白細胞的數(shù)量減少。據(jù)相關文獻報道，其化療性骨髓抑制的發(fā)生率高達70%至90%ADDINNE.Ref.{E2A2C827-DBDB-4513-8556-8F8FCB065046}[4]。根據(jù)課題組前期（2016年5月到2017年12月）在長征醫(yī)院開展的觀察性臨床試驗結果，在接受卡培他濱方案化療的127例結直腸癌患者當中，中性粒細胞減少癥的發(fā)生率為80.31%。其中，嚴重（大于二級）中性粒細胞減少癥發(fā)生率為的3.15%ADDINNE.Ref.{A6536EC1-EC49-48AE-868D-9823018210B2}[5]。化療藥物可以直接殺傷外周血白細胞，干擾或抑制正常粒細胞核酸的生物合成，進而影響粒細胞的代謝，阻礙粒細胞的分裂；化療藥物同時可以損傷骨髓造血干細胞，從而導致骨髓生成白細胞的能力下降ADDINNE.Ref.{16A13EA3-4585-48EC-BBA0-B1CEC6A1E9A0}[6]。白細胞減少典型表現(xiàn)為頭暈、肢體酸軟、乏力、食欲減退、精神萎靡、低熱等ADDINNE.Ref.{3246D785-10AB-4FDB-B124-5FB00E03D47B}[7]。由于基因、飲食習慣、環(huán)境的差異，不同患者對化療藥物的敏感性、耐受性都存在潛在差異。目前現(xiàn)有文獻中使用基因檢測和代謝組學的方法研究基因或內源性代謝物和化療不良反應之間的關系，用于預測結直腸癌患者接受化療后是否會出現(xiàn)不良反應。其中代謝組學是研究生物體系在受到外界刺激或者基因修飾時所引起其機體代謝物變化的一門學科ADDINNE.Ref.{0EAF42B9-E771-494D-BC1C-F356B9D075EA}[8]。代謝組學可以通過研究不良反應發(fā)生和未發(fā)生患者間內源性代謝物之間的差異離子或化合物，尋找代謝物和生理病理變化之間的潛在關系，進而篩選可以預測化療不良反應的內源性標志物。目前臨床上治療白細胞減少癥的西藥包括重組人粒細胞集落刺激因子、咖啡酸ADDINNE.Ref.{946569E6-C8CE-47F5-8667-C6428CADC6C5}[9]、VitaminB4、利血生、多抗甲素、鯊肝醇、碳酸鋰等。其在臨床使用中存在價格昂貴、不良反應較多、治療效果不穩(wěn)定等問題ADDINNE.Ref.{5145FB8D-786D-4E5E-BB81-71ECC5644C93}[10]。與西藥相比，中藥治療白細胞減少癥作用平穩(wěn)、價格低廉、能提高機體免疫功能，可以較好地改善其臨床癥狀ADDINNE.Ref.{47987226-BBBF-4009-8E76-D879AE01001E}[7]。雖然目前臨床上使用中藥預防化療所致白細胞減少癥獲得了可喜的進展ADDINNE.Ref.{951C7947-216C-4821-9709-143A9FF8FB8A}[11]，但是現(xiàn)在臨床上使用的中藥種類繁多，尚無綜述對不同中藥的療效進行比較。本研究旨在通過對患者術前血液和組織樣本進行代謝組學研究，運用軟件分析化療性白細胞減少癥發(fā)生和未發(fā)生患者間內源性代謝物的差異，篩選可能預測結直腸癌化療性白細胞減少癥的內源性標志物；運用薈萃分析方法對已發(fā)表的文獻進行系統(tǒng)全面的檢索，嚴格評價文獻質量，對文獻干預實驗結果進行統(tǒng)計分析，比較不同中藥的臨床療效，制定出最佳的中藥預防氟尿嘧啶類化療藥物所致白細胞減少的用藥方案。第一部分Chemotherapeuticleukopenia標志物的初步分析1材料1.1樣本來源組織樣本和血液樣本均來自課題組前期在上海市長征醫(yī)院收集的樣本。1.2主要儀器設備與試劑表1-1主要儀器設備Table1-1maininstrumentsandequipment儀器設備型號廠商UHPLC系統(tǒng)1290系列Agilent，美國四元泵G1311AAgilent，美國真空脫氣機G1322AAgilent，美國自動進樣器G1329AAgilent，美國柱溫箱G1316AAgilent，美國三重四級桿串聯(lián)質譜儀6530Q-TOF-MSAgilent，美國十萬分之一電子分析天平BP1106Sartorius，德國臺式冷凍離心機UNIVERSAL32RHettich，德國定時可調速漩渦混合器XW-01上海醫(yī)科大學儀器廠超聲儀SK7200H上?？茖С晝x器有限公司HILIC-Z（2.1×150mm）色譜柱No.673775-924Agilent，美國HILIC-Z(2.1×5mm）預柱No.821725-947Agilent，美國C181.7μm2.1×100mm色譜柱No.186005297Agilent，美國C181.7μm2.1×5mm預柱No.186005303Waters，美國表1-2主要實驗試劑

Table1-2mainexperimentalreagents儀器設備使用級別批號純度廠商p-氯化苯丙氨酸標準品C0253＞98%Sigma，美國甲酸銨標準品A5597≥98.0%SIGAMALDRICH，美國異丙醇分析純106＞99Merck，德國氯仿分析純C0761524023＞99Merck，德國甲酸色譜純TS0911CA1498%Tedia，德國甲醇色譜純JB03810799.9%Merck，德國乙腈分析純JA05910399.9%Merck，德國純凈水屈臣氏，中國2方法2.1樣品前處理2.1.1血液樣本對待測的血液樣本進行蛋白沉淀法的預處理方法，然后精密吸取0.2mL血漿于1.5mLEP管內，然后加入0.8mL的2：1（三氯甲烷：甲醇）的混合液并充分渦旋,然后在4℃的環(huán)境下使用12000r·min-1離心10min，精密吸取上層極性液體0.3mL同時加入0.9mL的甲醇渦旋，然后置于上述12000r·min-1的環(huán)境下離心10min，取上清液即為上層極性代謝物。使用移液槍槍頭尖端緩慢的穿過蛋白質圓盤精密的吸取下層有機相0.4mL，置于室溫下經過氮氣吹干，精密量取0.5mL的2：2：1（乙腈：異丙醇:水）混合液復溶即得下層非極性代謝物。分別對每個樣本的上下層精密吸取20μL，然后分別混合均勻作為質量控制樣樣品（QC）。2.1.2組織樣本取結直腸癌患者組織樣本，室溫下解凍，濾紙吸干表面血水，精密稱定質量約100mg，置于5ml離心管中，以1:5（m/v）比例加入0.9%氯化鈉注射液，于冰水浴下使用超細勻漿機15000r·min-1下勻漿2min制備組織勻漿液。勻漿液置于冰水浴下超聲5min后，再置于離心機中4℃、19060*g下離心15min，吸取上清液于-80℃下保存。取上清液0.2mL，加入萃取劑（三氯甲烷：甲醇）0.8mL，渦旋1min，再置于離心機中4℃、12000*g下離心10min。取上層含極性代謝產物的液體，加入含內標4-氯-DL-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽0.2μg·ml-1的乙腈，渦旋2min，在4℃、12000*g下離心10min，取上清液進樣；取下層非極性層0.1ml，于室溫下?lián)]干，使用乙腈：異丙醇：水=2:2:1進行復溶，渦旋2min，在4℃、12000*g下離心10min，取上清液進樣。取上述制備好的極性樣本，各取10μL，渦旋2min，在4℃、12000*g下離心10min，取上清液作為記性代謝產物的質控樣本；同理制備非極性代謝產物的質控樣本。2.2UHPLC-Q-TOF-MS檢測條件2.2.1血液樣本表1-3血液樣品色譜檢測條件Table1-3chromatographicdetectionconditionsofbloodsamples檢測條件極性非極性系統(tǒng)安捷倫1290超高效液相色譜（UHPLC）系統(tǒng)安捷倫1290超高效液相色譜（UHPLC）系統(tǒng)色譜柱HILIC-Z2.1×150mm色譜柱+HILIC-Z2.1×5mm預柱T33.5μm2.1×100mm色譜柱+C181.7μm2.1×5mm預柱柱溫40℃65℃流速0.5mL·min-10.3mL·min-1流動相A純水（10mM甲酸銨）60%乙腈的水溶液（0.1%甲酸+10mm甲酸銨）流動相B90%乙腈（10mM甲酸銨）90%的異丙醇的水溶液（0.1%甲酸+10mm甲酸銨）進樣體積10μL10μL表1-4極性分子梯度洗脫條件Table1-4polarmoleculargradientelutionconditions時間(min)A(%)B(%)00100529812138713168420307024604024.1703028703028.10100330100表1-5非極性分子梯度洗脫條件Table1-5non-polarmoleculargradientelutionconditions時間(min)A(%)B(%)09010490105653512.540601919919.58515298515表1-6質譜檢測條件Table1-6massspectrometrydetectionconditions檢測條件極性非極性系統(tǒng)安捷倫6530四級桿-飛行時間質譜（Q-TOF-MS）系統(tǒng)安捷倫6530四級桿-飛行時間質譜（Q-TOF-MS）系統(tǒng)采集模式全信息串聯(lián)質譜（MSE）離子模式正離子/負離子正離子毛細管電壓4000V4000V截取錐電壓65V65V氣體溫度350℃350℃氣體流速11L·min-111L·min-1捕獲范圍100~1700m/z100~1700m/z2.2.2組織樣本表1-7組織樣品色譜檢測條件Table1-7chromatographicdetectionconditionsoftissuesamples檢測條件極性非極性系統(tǒng)安捷倫1290超高效液相色譜（UHPLC）系統(tǒng)安捷倫1290超高效液相色譜（UHPLC）系統(tǒng)色譜柱HILIC-Z2.1×150mm色譜柱+HILIC-Z2.1×5mm預柱HILIC-Z2.1×150mm色譜柱+HILIC-Z2.1×5mm預柱柱溫40℃65℃流速500μL·min-1300μL·min-1流動相A純水（10mM甲酸銨）60%乙腈的水溶液（0.1%甲酸+10mM甲酸銨）流動相B90%乙腈（10mM甲酸銨）異丙醇：水=9：1（0.1%甲酸+10mM甲酸銨）進樣體積10μL5μL表1-8極性分子梯度洗脫條件Table1-8polarmoleculargradientelutionconditions時間(min)A(%)B(%)00100529812138713168420307024604024.1703028703028.10100330100表1-9非極性分子梯度洗脫條件Table1-9non-polarmoleculargradientelutionconditions時間(min)A(%)B(%)09010490105653512.540601919919.58515298515表1-10質譜檢測條件Table1-10massspectrometrydetectionconditions檢測條件極性非極性系統(tǒng)安捷倫6530四級桿-飛行時間質譜（Q-TOF-MS）系統(tǒng)安捷倫6530四級桿-飛行時間質譜（Q-TOF-MS）系統(tǒng)采集模式全信息串聯(lián)質譜（MSE）全信息串聯(lián)質譜（MSE）離子模式正離子/負離子正離子/負離子毛細管電壓4000V4000V截取錐電壓60V60V氣體溫度300℃350℃氣體流速13L·min-111L·min-1捕獲范圍100~1700m/z100~1700m/z2.3數(shù)據(jù)分析方法運用安捷倫定性分析軟件Profinder對原始數(shù)據(jù)進行初步提取、面積歸一化處理，將結果轉化為包含化合物保留時間和質合比等信息的txt文件。提取其中化療性白細胞減少癥發(fā)生和未發(fā)生患者的數(shù)據(jù)，運用MetaboAnalyst軟件進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘投影判別分析(PLSDA)，制作火山圖進行載荷圖篩選，通過分析對各組分離貢獻較大(P<0.05,FC>1)化合物的串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)，經過HDMB數(shù)據(jù)庫中LC-MS檢索(IonMode:Neutral;AdductType:M;MolecularWeightTolerance±:2ppm)，進行質譜信息匹配，篩選其中內源性差異化合物。3結果3.1血液潛在極性化合物PCA得分圖（見圖1A）所示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組組間代謝物區(qū)分不明顯，但仍顯示兩組間代謝物差異的趨勢。為了進一步放大兩組組間差異，采用PLSDA的方法進行處理，其PLSDA得分圖（見圖1B）顯示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組可以明顯的區(qū)分。運用Vocanonplot分析（見圖1C）兩組間離子峰的差異，篩選出P<0.05、組間差異FC>1的特征離子峰共118個。通過對比HMDB（人類代謝組數(shù)據(jù)庫）進一步的篩選其中內源性的差異化合物，最后篩選出差異性極性化合物共5個（見表1-11NO.1-5）。AABC圖1-1發(fā)生組和未發(fā)生組血液極性代謝物對比A.PCA圖，B.PLSDA圖，C.火山圖Figure1-1comparisonofbloodpolaritymetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)3.2血液潛在非極性化合物PCA得分圖（見圖1-2A）所示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組組間區(qū)別不明顯。為了進一步放大兩組組間的差異，采用PLSDA的方法進行處理，其PLSDA得分圖（見圖1-2B）顯示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組可以明顯的區(qū)分。運用Vocanonplot分析（見圖1-2C）兩組間離子峰的差異，篩選出P<0.05、組間差異FC>1的特征離子峰共41個。通過對比HMDB（人類代謝組數(shù)據(jù)庫）進一步的篩選其中內源性的差異化合物，最后篩選出差異性非極性化合物共2個（見表1-11NO.6-7）。AABC圖1-2發(fā)生組和未發(fā)生組血液非極性代謝物對比A.PCA圖，B.PLSDA圖，C.火山圖Figure1-2comparisonofbloodnon-polarmetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)3.3組織潛在極性化合物PCA得分圖（見圖1-3A）所示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組代謝物組間區(qū)別不明顯，但仍顯示兩組間代謝物差異的趨勢。為了進一步放大兩組組間的差異，采用PLSDA的方法進行處理，其PLSDA得分圖（見圖1-3B）顯示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組可以明顯的區(qū)分。運用Vocanonplot分析（見圖1-3C）兩組間離子峰的差異，篩選出P<0.05、組間差異FC>1的特征離子峰共74個。通過對比HMDB（人類代謝組數(shù)據(jù)庫）進一步的篩選其中內源性的差異化合物，最后篩選出差異性極性化合物共1個（見表1-12NO.1）。AABC圖1-3發(fā)生組和未發(fā)生組組織極性代謝物對比A.PCA圖，B.PLSDA圖，C.火山圖Figure1-3comparisonoftissuepolaritymetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)3.4組織潛在非極性化合物PCA得分圖（見圖1-4A）所示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組之間區(qū)別不明顯，但仍顯示兩組間代謝物差異的趨勢。為了進一步放大兩組之間的差異，采用PLSDA的方法進行處理，其PLSDA得分圖（見圖1-4B）顯示，化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組可以明顯的區(qū)分。運用Vocanonplot分析（見圖1-4C）兩組間離子峰的差異，篩選出P<0.05、組間差異FC>1的特征離子峰共59個。通過對比HMDB（人類代謝組數(shù)據(jù)庫）進一步的篩選其中內源性的差異化合物，最后篩選出差異性非極性化合物共3個（見表1-12NO.2-4）。AABC圖1-4化療性白細胞減少癥發(fā)生組和未發(fā)生組組織非極性謝物對比A.PCA圖，B.PLSDA圖，C.火山圖Figure1-4comparisonoftissuenonpolaritymetabolitesbetweentheoccurrencegroupandthenon-occurrencegroup(A.PCAplot,B.PLSDAplot,c.volcanoplot)表1-11血液中與白細胞減少癥潛在相關的化合物Table1-11compoundsinthebloodpotentiallyassociatedwithleukopeniaNOMassRTPolarityLeukopeniaNoLeukopeniaP-valueNameHMDBKEGG.IDClass1755.54549.6290polar201.84±88.9476.24±68.220.0068PC(14:1/20:2)0007913C00157GlycerophospholipidsPC(14:0/20:3)0007882C00157Glycerophospholipids2694.47859.3480polar13.65±5.046.93±7.200.0108PG(12:0/18:0)0116666n/aGlycerophospholipidsPG(14:0/16:0)0116697n/aGlycerophospholipids3399.33415.0810polar15.06±11.338.49±3.930.0338Palmitoylcarnitine0000222C02990FattyAcyls4693.45736.9760polar0.24±0.911.69±2.370.0440PS(14:0/15:0)0112273n/aGlycerophospholipidsPS(15:0/14:0)0112320n/aGlycerophospholipids5228.14710.8350polar15.07±12.0417.58±9.470.0460Leucylproline0011175n/aCarboxylicacidsandderivatives6704.12710.7820Nonpolar2.67±2.460.84±1.090.0195L-Acetylcarnitine0000201n/aFattyAcyls7260.148421.0939Nonpolar12.81±7.356.56±6.330.0452Asparaginyl-Lysine0028736n/aCarboxylicacidsandderivatives表1-12組織中與白細胞減少癥潛在相關的化合物Table1-12compoundsintissuespotentiallyassociatedwithleukopeniaNOMassRTPolarityLeukopeniaNoLeukopeniaP-valueNameHMDBKEGG.IDClass1177.13911.3059polar0.12±0.110.05±0.060.0158N-Methylnicotinium0001009n/aPyridinesandderivatives2755.5461495.33179.43603.8999Nonpolar0.17±0.283.73±3.080.71±0.7427.07±29.410.00420.0076PC(14:1/20:2)0007913C00157Glycerophospholipids3NonpolarLysoPC(16:0)0010382C04230Glycerophospholipids4618.521412.2069Nonpolar7.11±8.8617.60±18.310.0356DG(16:1n7/0:0/20:2n6)0056165n/aFattyAcylsDG(14:1n5/0:0/22:2n6)0056147n/aGlycerolipidsDG(18:0/0:0/18:3n3)0056056n/aFattyAcylsDG(18:0/0:0/18:3n6)0056049n/aFattyAcylsDG(16:0/0:0/20:3n6)0056025n/aFattyAcylsDG(16:0/0:0/20:3n9)0056019n/aGlycerolipids618.521412.2069Nonpolar7.11±8.8617.60±18.310.0356DG(20:3(8Z,11Z,14Z)/16:0/0:0)0007475n/aFattyAcylsDG(20:3(5Z,8Z,11Z)/16:0/0:0)0007446n/aFattyAcylsDG(20:2(11Z,14Z)/16:1(9Z)/0:0)0007418n/aFattyAcylsDG(18:3(9Z,12Z,15Z)/18:0/0:0)0007303n/aFattyAcylsDG(18:3(6Z,9Z,12Z)/18:0/0:0)0007274n/aFattyAcylsDG(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z)/0:0)0007247n/aFattyAcylsDG(18:2(9Z,12Z)/18:1(11Z)/0:0)0007246n/aFattyAcylsDG(18:1(9Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)0007219n/aFattyAcylsDG(18:1(11Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)0007190n/aFattyAcylsDG(18:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)0007163n/aFattyAcylsDG(18:0/18:3(6Z,9Z,12Z)/0:0)0007162n/aFattyAcylsDG(16:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)/0:0)0007138n/aGlycerolipidsDG(16:0/20:3(8Z,11Z,14Z)/0:0)0007111n/aGlycerolipidsDG(16:0/20:3(5Z,8Z,11Z)/0:0)0007110n/aGlycerolipidsDG(22:2(13Z,16Z)/14:1(9Z)/0:0)0007647n/aGlycerolipidsDG(14:1(9Z)/22:2(13Z,16Z)/0:0)0007059n/aGlycerolipids4討論在本研究發(fā)現(xiàn)血液中潛在極性內源性標志物8個，其中包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰甘油-甘油磷脂(PG)、L-棕櫚酰、磷脂酰絲氨酸(PS)、亮氨酰脯氨酸五類化合物；血液中發(fā)現(xiàn)潛在非極性內源性標志物2個，其中包括L-乙酰、天冬酰胺酰賴氨酸；組織中發(fā)現(xiàn)潛在極性標志物N-Methylnicotinium；組織中發(fā)現(xiàn)潛在非極性內源性標志物3個，其中包括磷脂酰膽堿、溶血磷脂、甘油二酯三類化合物。上述發(fā)現(xiàn)的內源性代謝物中除天冬酰胺酰賴氨酸（有機酸衍生物）和N-Methylnicotinium（有機雜環(huán)化合物）外，其余化合物均為脂類。脂類是人體的重要組成成分，參與生命體能量儲存和信息的傳遞ADDINNE.Ref.{7D95801F-CB85-4D32-8A71-631E5F3FA7E8}[12]。在本研究中主要涉及卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等甘油磷脂和脂肪酸甘油脂類。PS的含量水平和化療性白細胞減少癥的發(fā)生密切相關。DruckerLADDINNE.Ref.{4E047FD1-EBA0-42DE-914A-9C34B901AABB}[13]等研究PS水平與白細胞對細胞毒性藥物的反應之間的關系。研究表明結直腸癌患者在接受5-氟尿嘧啶治療前，其初始PS水平越高，服用化療藥物對白細胞的作用越小，反之亦然。這一研究結果充分的解釋了表1-11中白細胞減少癥發(fā)生組PS水平明顯高于未發(fā)生組的原因。卵磷脂（PC）是細胞膜結構的重要組成部分，其在細胞周期中的含量與細胞增殖相關。卵磷脂的含量過多或過少都阻礙細胞增殖的正常進行，使細胞停留在細胞周期的某一階段。ADDINNE.Ref.{5E4AD9EE-EB89-4AFB-B853-60E752A6613F}[14]。在表1-11中白細胞減少癥發(fā)生組的PC水平顯著的高于未發(fā)生組，其提示白細胞減少癥的發(fā)生可能和卵磷脂的含量過高相關。上述發(fā)現(xiàn)的潛在內源性標志物在有效鑒別化療性白細胞減少癥的易感人群方面的作用還有待于進一步考察。通過篩選和鑒定可靠的內源性標志物，將其與現(xiàn)有臨床檢測方法相結合，制定出一套更為完善的不良反應預測方法，有效地鑒別結直腸癌患者中化療性白細胞減少癥的易感人群，對于此類結直腸癌患者提高警惕，密切監(jiān)測其用藥反應和白細胞水平，必要時在化療同時加用升白藥物或換用其他治療方法可以有效地減少結直腸癌患者接受5-氟尿嘧啶類藥物治療時白細胞減少癥的發(fā)生。第二部分Chemotherapeuticleukopenia中藥復方預防方案的Meta分析1資料與方法 1.1納入和排除標準1.1.1納入標準①文獻實驗設計類型為RCT；②研究對象為結直腸癌診斷明確的患者；③化學治療方案中必須要包含5-氟尿嘧啶類的化療藥物；④必須使用中藥處方或中藥制劑來預防化療性白細胞減少癥；⑤結果中必須報告有關白細胞減少癥的發(fā)生人數(shù)或白細胞計數(shù)；⑥文獻類別限定為期刊。1.1.2排除標準①非臨床隨機對照實驗；②結果中未報告白細胞減少相關數(shù)據(jù)；③化療方案中不包含卡培他濱等5-氟尿嘧啶類的化療藥物。1.2檢索策略通過計算機檢索中國知網(CNKI),維普數(shù)據(jù)庫(VIPDatabase),萬方數(shù)據(jù)庫(WanfangDatabase)、中國生物醫(yī)學數(shù)據(jù)庫(SinoMed)四個常用中文數(shù)據(jù)庫，以Cochrane協(xié)作網檢索策略規(guī)范制定檢索策略，以結直腸癌與化療與（中藥或中醫(yī)藥或中草藥）為檢索詞進行主題檢索，系統(tǒng)全面收集2001年至2018年公開發(fā)表的有關中藥預防結直腸癌患者接受5-氟尿嘧啶類化療藥物治療所致化療性白細胞減少癥的文獻資料。1.3納入研究文獻的質量評價標準對所納入研究的原始文獻圍繞以下五個方面進行嚴格無偏倚的質量評價：①是否詳細地描述實驗隨機方法以及所選用的隨機分配方法是否正確；②是否報告分配隱藏的情況；③是否采用了盲法及盲法是否正確；④是否詳細描述失訪及退組的情況；⑤各組間基線情況是否可比性。若基本滿足上述標準評為A級；若僅能部分滿足上述標準評為B級；若完全不能滿足評為C級ADDINNE.Ref.{59B4D588-3088-4DE2-921D-7583A92CEA90}[15]。1.4數(shù)據(jù)提取提取納入研究文獻重要信息，建立統(tǒng)計表格，包括文獻一般信息（論文題目、作者、發(fā)表年限）、RCT設計方法（隨機分配方法、分配隱藏、盲法、失訪及退組）、干預和對照措施（中藥藥方、服藥時機、對照方法、對照藥物）、RCT結果、基線情況（患者的年齡、性別、病程等）。1.5資料分析統(tǒng)計方法使用RevMan5.3軟件進行分析，統(tǒng)計各臨床隨機對照實驗中對照組和實驗組化療性白細胞減少癥的發(fā)生人數(shù)和總人數(shù)，采用x2和I2值對各RCT之間異質性進行檢驗，以P=0.1、I2=0.5為檢驗水平。若各RCT間異質性較小(P≥0.1或I2＜0.5)選擇固定效應模型；若RCT異質性較大(P＜0.1或I2＞0.5)則選擇隨機效應模型。結果計量資料采用比值比(OR)表示，區(qū)間估計均采用95％CI表示。2結果2.1檢索及篩選結果通過1.2中的檢索策略共獲得4983篇文獻，其中中國知網274篇、維普數(shù)據(jù)庫44篇、萬方數(shù)據(jù)庫2428篇、生物醫(yī)學數(shù)據(jù)庫2237篇。根據(jù)1.1納入與排除標準標準初步篩選文獻共計73篇。在初篩文獻資料中篩選使用同種中藥處方或中藥制劑且各臨床隨機對照實驗的對照類型、結果表示方法相同的文獻資料，最終納入13篇文獻，其中艾迪注射液7篇、康艾注射液2篇、升血湯2篇、君子扶正湯2篇。2.2納入研究文獻質量評價在對照方法方面，13篇文獻中平行對照實驗均采用空白對照；在隨機方法方面，除李明ADDINNE.Ref.{1C8A2BC5-D547-4124-B6EF-6DFFB91E6AEA}[16]2017、許煒茹ADDINNE.Ref.{7B632492-3C24-4397-9F43-4CA2E91A4D65}[17]2015兩篇文獻明確說明采用隨機數(shù)字表法以外，其余文獻均只提及隨機但并未指明隨機分配方法；所有文獻均未提及分配隱藏、盲法、失訪與退組；所有文獻基線情況均可比；根據(jù)1.4納入研究文獻的質量評價標準，13篇文獻質量均為C級。2.3納入研究文獻特征在化療方案方面，陳寶ADDINNE.Ref.{6E3C0ED9-DF99-4620-9A41-ED1B9C0A826D}[18]2017、樊松ADDINNE.Ref.{18892266-B95A-4D2C-A40B-11E2B0B90332}[19]2010、王冰ADDINNE.Ref.{0A1121F1-E400-4A60-B972-7789712A5CBF}[20]2017、李明2017、周林平ADDINNE.Ref.{AE856F3F-1613-408F-833E-9D8576D1DD9F}[21]2016、雷竹ADDINNE.Ref.{CC1E9F2F-3520-46DC-9D39-49FA175570BD}[22]2012六篇文獻采用FOLFOX4方案（奧沙利鉑、亞葉酸鈣、氟尿嘧啶）；呂遐智ADDINNE.Ref.{A11E1E3E-93F9-4E46-804C-2C3398EBAF8D}[23]2017、施兵ADDINNE.Ref.{27D59D75-30F1-4B97-B3D8-4A0EB686F0CB}[24]2009、姚嵋方ADDINNE.Ref.{02D5A825-6FDE-4768-BC9A-AFA1E910D78F}[25]2016、許煒茹2015四篇文獻采用XELOX方案（奧沙利鉑、卡培他濱）；吳雪元ADDINNE.Ref.{360CE916-7EDD-41F3-AEF5-532C8E844A03}[26]2012一篇文獻采用FOLFIRI方案（伊立替康、亞葉酸鈣、氟尿嘧啶）；楊朝流ADDINNE.Ref.{A42BD3D9-6109-47B4-A90E-CC297F0850AF}[27]2012一篇文獻采用mFOLFOX6方案（奧沙利鉑、亞葉酸鈣、5-氟尿嘧啶）；劉濤ADDINNE.Ref.{00BD40DF-9EA4-41E2-AE1B-7B3AA9A31A03}[28]2009一篇文獻采用FOLFOX6方案（伊立替康、亞葉酸鈣、5-氟尿嘧啶）。在中藥服藥時機方面，所有干預實驗均與化療同時服用中藥；在統(tǒng)計結果方面，所有文獻均采用白細胞減少不良反應發(fā)生人數(shù)或發(fā)生率表示。2.4薈萃分析結果2.4.1艾迪注射液共七篇文獻使用艾迪注射液預防5-氟尿嘧啶類化療藥物所致的白細胞減少癥。實驗組共計217人、對照組共計215人。薈萃分析結果表明異質性較?。≒=0.67,I2=0%），實驗組和對照組間具有統(tǒng)計學差異(OR:0.28,95%CI：0.18-0.43,P<0.00001)，艾迪注射液可以有效降低結直腸癌患者使用5-氟尿嘧啶類藥物化療后白細胞減少癥的發(fā)生率（見圖2-1）。2.4.2君子扶正湯共兩篇文獻使用君子扶正湯預防5-氟尿嘧啶類化療藥物所致的白細胞減少癥。實驗組共計75人、對照組共計75人。薈萃分析結果表明異質性較?。≒=0.95,I2=0%），實驗組和對照組間具有統(tǒng)計學差異(OR:0.20,95%CI:0.10-0.41,P<0.00001)，君子扶正湯可以有效降低結直腸癌患者使用5-氟尿嘧啶類藥物化療后白細胞減少癥的發(fā)生率（見圖2-1）。2.4.3康艾注射液共兩篇文獻使用康艾注射液預防5-氟尿嘧啶類化療藥物所致的白細胞減少癥。實驗組共計60人、對照組共計60人。薈萃分析結果表明異質性較?。≒=0.91,I2=0%），實驗組和對照組間不具有統(tǒng)計學差異(OR:0.52,95%CI:0.20-1.32,P=0.17)，康艾注射液不能降低結直腸癌患者使用5-氟尿嘧啶類藥物化療后白細胞減少癥的發(fā)生率（見圖2-1）。2.4.4升血湯共兩篇文獻使用升血湯預防5-氟尿嘧啶類化療藥物所致的白細胞減少癥。實驗組共計90人、對照組共計90人。薈萃分析結果表明異質性較?。≒=0.91,I2=0%），實驗組和對照組間具有統(tǒng)計學差異(OR:0.42,95%CI:0.20-0.87,P=0.02)，升血湯可以有效降低結直腸癌患者使用5-氟尿嘧啶類藥物化療后白細胞減少癥的發(fā)生率（見圖2-1）。圖2-1薈萃分析森林圖Figure2-1meta-analysisforestmap3討論白細胞的生成自造血干細胞(hematopoieticstemcell,HSC)開始，至最終多種白細胞的生成，是一個多步驟過程，受到多種調控因子的影響（圖2-2）。HSC具有自我更新和多向分化能力。其自我更新過程受內源性機制（細胞自身調控）和外源性機制（細胞所處微環(huán)境中成分調控）共同調控。HSC多向分化可通過多種造血生長因子調控，先分化為共同淋巴樣祖細胞和共同髓系祖細胞ADDINNE.Ref.{F2DD7D7C-5EDF-43E8-AD76-0A4B7CDF0613}[29]。前者先分化為成小淋巴細胞，再進一步向B系、T系、NK系分化并最終生成成熟的B淋巴細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞；后者在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用下分化為成髓細胞，成髓細胞進一步分化最終生成成熟的粒細胞（嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞）和單核細胞ADDINNE.Ref.{FE52E121-F9D6-4D8A-8D67-92C0BE8EC3C9}[30]。圖2-2白細胞生成過程圖Figure2-2.LeukocytogenesisHSC的多向分化過程受多種造血生長因子的調控。白細胞介素3(IL-3)可以促進多能造血干細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞的增殖和分化ADDINNE.Ref.{B7FE4126-043F-4758-859D-09A1449E3FF2}[31]。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)對造血祖細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等粒系細胞、單核細胞的生長具有促進作用ADDINNE.Ref.{539ED1B9-FDB0-461C-819E-50068C7F2ED9}[32]，并且能延長造血祖細胞、成熟中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的存活時間，增強其功能。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)可促進中性粒細胞的生成和釋放，并提升其細胞功能ADDINNE.Ref.{D71D05C3-AE05-4B55-A693-B8CABEF4E1E9}[33]。干細胞因子(SCF)對造血細胞的增殖和分化具有促進作用，可以調控各類血細胞生長，進而促進白細胞的生成。SCF可以刺激最早期造血干細胞的增殖與分化ADDINNE.Ref.{8D9EE4C5-B2A8-4DFC-AE86-F19DF10F4A2A}[34]，能夠和多種造血生長因子共同促進白細胞的生成。目前，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)、IL-3ADDINNE.Ref.{437037A8-F2BF-4ED0-8748-8E20E4E050EE}[9]、SCF已廣泛應用于各種原因所致白細胞減少癥的治療。艾迪注射液、君子扶正湯、升血湯的多種成分可以通過影響上述白細胞的生成過程及其調控因子，有效地促進白細胞的生成，從而預防化療性白細胞減少癥的發(fā)生。艾迪注射液中包含斑蝥、人參、黃芪、刺五加四味中藥材。其中斑蝥有效成分去甲斑蝥素(NCTD)可調控機體骨髓細胞中GM-CSF的表達并影響其在外周血中的分布ADDINNE.Ref.{D33CC88E-3567-4256-B4BC-13FFAFF3A372}[35]，GM-CSF能夠促進造血祖細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等細胞的分化；斑蝥素可以通過縮短白細胞在骨髓成熟的時間并促進其釋放,同時可以促進HSC向粒-單核系祖細胞分化,從而增加白細胞數(shù)量ADDINNE.Ref.{479E771E-9830-4C78-9AC4-818DE66C0276}[36]；此外，人參中的有效成分人參皂苷可以刺激人體骨髓造血功能增強，進而提高淋巴細胞數(shù)量ADDINNE.Ref.{E4B72281-3D86-44BB-B936-84BAAFB8BB99}[37]；黃芪中的有效成分黃芪多糖具有保護保護骨髓的作用，同時可以刺激體外人造血干細胞的增殖和分化，從而促進白細胞的生成ADDINNE.Ref.{AFA211E0-E2E7-483B-904F-AD8EB2A15AEE}[38]；刺五加可以明顯地刺激淋巴細胞的增殖，其與增加白細胞數(shù)目呈正相關ADDINNE.Ref.{1E948545-6B3C-4D30-94B2-C802C1B46A14}[39]；君子扶正湯中包括人參、黃芪、白術、當歸、茯苓、蛇舌草、并頭草、炙甘草。除人參、黃芪以外，當歸的有效成分當歸多糖可以促進人體產生造血調控因子，其對HSC和CFU-GM層的分化具有促進作用，激活骨髓造血功能，促進多種造血祖細胞的分化，進而升高外周血白細胞水平ADDINNE.Ref.{E420CCD2-6214-4222-9B38-ED43EA239D90}[40]。扶正君子湯的其他中藥藥材尚沒有發(fā)現(xiàn)有明確治療白細胞減少癥的藥理機制。升血方劑中包括太子參、生黃芪、雞血藤、炒白術、懷牛膝、西洋參、鹿角膠。其中太子參醇可以顯著提升白細胞吞噬功能，并能增加外周血白細胞數(shù)ADDINNE.Ref.{B5803F33-3FA3-4798-A4DA-EC8DA9D02C44}[40]。雞血藤當中的活性成分能夠刺激造血祖細胞，促進其增殖和分化，進而增加白細胞的數(shù)量ADDINNE.Ref.{2F3913DF-1240-4C9E-A4FE-06AECF18C64C}[41]；懷牛膝有效成分牛膝多糖可以有效的預防環(huán)磷酰胺所致的白細胞減少癥ADDINNE.Ref.{CEF10CA6-4ADC-4FB9-93F6-C2AA593456A6}[42]。西洋參中西洋參根粗多糖(PPQ)對于化療所致的白細胞減少有明顯的抑制作用，還可能通過脾間質細胞增生促進代償性髓外造血ADDINNE.Ref.{2E35A998-11F2-4882-B15C-A32639A2F977}[43]。尚未有相關文獻表明炒白術及鹿角膠具有升白作用。綜上所述，艾迪注射液、君子扶正湯、升血湯預防白細胞減少癥的機制具有明確藥理學研究支撐。艾迪注射液中的斑蝥、人參、黃芪、刺五加，君子扶正湯中的人參、黃芪、當歸，與升血方劑中的太子參、生黃芪、雞血藤、懷牛膝、西洋參都具有直接促進白細胞生成的作用。但尚未有文獻明確報道化療效果是否會受到這些中藥處方或制劑的影響。為了有效降低化療性白細胞減少癥發(fā)生率，提高化療安全性，建議在不影響5-氟尿嘧啶類藥物化療效果的前提下，為結直腸癌患者中化療性白細胞減少癥的易感人群使用上述輔助中藥方案。以上薈萃分析內容已編撰成文，正在投稿中。結論運用代謝組學的研究方法，在入組結直腸癌患者血液和組織樣本中共找到潛在內源性標志物共11個。篩選的潛在內源性標志物主要為脂類，其與化療性白細胞減少癥的發(fā)生存在相關性；運用薈萃分析的方法，篩選出有效預防化療性癥的白細胞減少中藥處方或制劑共三種，包括艾迪注射液、君子扶正湯、升血湯。通過文獻查找，證明有三種中藥處方或制劑有明確預防化療性白細胞減少癥的藥理機制，推薦臨床使用。參考文獻[1]杜楠.結直腸癌治療進展[J].中國癌癥防治雜志,2017,9(05):350-355.[2]林丹丹,張一橋,陳能,等.卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑對比氟尿嘧啶聯(lián)合奧沙利鉑治療結直腸癌療效與安全性的Meta分析[J].中國腫瘤,2016,25(11):927-932.[3]楊薇.HPLC-MS/MS法同時分析血漿中卡培他濱及其代謝物[D].復旦大學碩士學位論文，2013:5-8.[4]Schwartz,R.N.Anemiainpatientswithcancer:Incidence,causes,impact,management,anduseoftreatmentguidelinesandprotocols[J].AmericanJournalofHealth-SystemPharmacy,2007,64(3Supplement2):S5-S13.[5]陳偉,李明明,姚厚山,等.腫瘤標志物和炎性指標對結直腸癌診斷和化療不良反應預測的臨床價值[J].腫瘤,2018,38(11):1038-1047.[6]田劭丹,董青,祁爍,等.化療后白細胞減少癥中醫(yī)藥防治與評估專家共識[J].現(xiàn)代中醫(yī)臨床,2018,25(03):1-6.[7]林玉冰,黎靜.穴位按摩、中藥對結直腸癌化療患者白細胞減少的效果觀察[J].內蒙古中醫(yī)藥,2018,37(02):70-71.[8]戚文娟,田雪嬌,周長江.代謝組學在結直腸癌中的研究進展[J].醫(yī)學與哲學(B),2013,34(06):62-64.[9]劉亞坤,張洪亮.惡性腫瘤化療所致粒細胞減少的防治進展[J].新疆中醫(yī)藥,2018,36(04):130-132.[10]馬曉蘭,陶可勝,李靜.腫瘤化療后白細胞減少癥的中西醫(yī)治療進展[J].中國當代醫(yī)藥,2015,22(08):16-19.[11]馬曉蘭,陶可勝,李靜.腫瘤化療后白細胞減少癥的中西醫(yī)治療進展[J].中國當代醫(yī)藥,2015,22(08):16-19.[12]陳明玉.脂類物質的生物學功能與人體保健[J].科技信息(科學教研),2007(19):34.[13]Drucker,L.,etal.,Initialexposedphosphatidylserinelevelscorrelatewithcellularresponsetocytotoxicdrugs.EurJHaematol[J],2003.70(2):98-105.[14]常平安,秦文珍,魏進民.卵磷脂與細胞周期[J].中國生物化學與分子生物學報,2006(12):947-952.[15]王妍,馬懷幸,劉天舒.重組人血小板生成素治療腫瘤化療所致血小板減少癥的薈萃分析[J].循證醫(yī)學,2013,13(04):225-229.[16]李明.君子扶正湯對結直腸癌術后化療患者生存質量及免疫功能的影響[J].中國合理用藥探索,2017,14(10):8-10.[1