水稻籽實(shí)中cd、pb結(jié)合形態(tài)及其穩(wěn)定性研究

水稻籽實(shí)中cd、pb結(jié)合形態(tài)及其穩(wěn)定性研究

人們越來越關(guān)注食品中重金屬的暴露。由于不同形式的重金屬對(duì)動(dòng)物和人類的毒性不同，從20世紀(jì)80年代以來，研究了食品中的重金屬形式，如大豆、貝類、谷物等。我們還研究了水稻、小麥、谷物中cd、pb等有毒元素的存在形式。結(jié)果表明，糧食中的重金屬主要與蛋白質(zhì)結(jié)合。然而，由于水質(zhì)變化、重金屬提取物和酶消化的變化，環(huán)境條件惡化，重金屬結(jié)合形式的穩(wěn)定性。因此，研究食物中重金屬的結(jié)合形式和穩(wěn)定性對(duì)評(píng)估它們的毒性非常重要。谷物等食品是人類的主食,人體吃食,先要經(jīng)過蒸煮,食物進(jìn)入人體胃里后會(huì)受到各種消化酶的作用.在蒸煮和消化酶的作用下,食物中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變,與蛋白質(zhì)結(jié)合的重金屬形態(tài)也會(huì)發(fā)生變化.本文擬通過模擬實(shí)驗(yàn),探討蒸煮和消化酶等環(huán)境條件對(duì)蛋白質(zhì)-Cd、Pb結(jié)合形態(tài)穩(wěn)定性的影響,為進(jìn)一步評(píng)價(jià)谷物中重金屬的毒性提供依據(jù).1材料和方法1.1樣本來源試驗(yàn)所選用的稻谷采自湖北省大冶銅礦區(qū)和云南蘭坪縣鉛、鋅礦山附近的污染農(nóng)田.1.2樣品的制備和測定稻谷去穎殼,研磨,然后脫去脂肪,風(fēng)干后稱取適量,用0.05mol/LTris-HCl(pH7.5)進(jìn)行提取,樣品與提取液之比為1∶10.將提取液樣品置于冰箱內(nèi)10h后,在20000g的高速冷凍離心機(jī)中離心1h,取上清液于冰凍干燥箱內(nèi)濃縮5倍.取濃縮樣品1mL用0.05mol/LTris-HCl溶解,經(jīng)SephadexG75柱進(jìn)行層析分離(2.0cm×100cm).用0.02mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5)進(jìn)行洗脫.用自動(dòng)部分收集器(BS2-100)以4mL/20min的流速,每管收集4mL洗脫液.紫外分光光度計(jì)(BECKMANDU-8B)測定洗脫液的紫外吸收峰(225nm處),并同步測定洗脫液中的Cd、Pb濃度.采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線法測定洗脫液樣品的分子量.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為:牛血清蛋白(分子量66000)、雞卵清蛋白(分子量45000)、胰蛋白酶(分子量24000)、細(xì)胞色素C(分子量12400)、胰島素(分子量5734),均為層析純.將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液與樣品相同的方法經(jīng)SephadexG75柱層析,繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線.1.3蛋白質(zhì)和凝膠層析分離準(zhǔn)確稱取一定量的被研磨的稻米置于燒杯中,加適量的去離子水,在電爐上加熱,煮熟成米飯.然后,按步驟1.2的方法提取蛋白質(zhì)和凝膠層析分離.1.4胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化實(shí)驗(yàn)1.4.1輸注trs-hcl溶液胃蛋白酶溶液(16mg/L):稱取胃蛋白酶160mg(Pepsin1:10000,SigmaP7000,539units/mg,華美生物工程公司),溶于10mL0.02mol/LTris-HCl溶液(pH7.0).胰蛋白酶溶液(30mg/L):稱取胰蛋白酶300mg(Trypsin1∶250,LotNo.BE2185,華美生物工程公司),溶于10mL0.02mol/LTris-HCl溶液(pH7.0).1.4.2凝膠層析分離5mL冷凍干燥的水稻蛋白質(zhì)提取液,分別溶于1mL胃蛋白酶溶液和1mL胰蛋白酶溶液,對(duì)照組分別加1mL無酶的0.02mol/LTris-HCl溶液,37℃恒溫培養(yǎng)5h,然后按步驟1.2的方法凝膠層析過柱分離.1.5分析方法的確定將凝膠層析洗脫液樣品經(jīng)硝酸、高氯酸消化后用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)(GBC906,澳大利亞)測定其含量.為了保證分析方法的準(zhǔn)確性,采用了國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制.2結(jié)果與討論2.1糙米中cd、pb蛋白多肽的表觀分子量脫脂水稻籽實(shí)樣品用0.05mol/LTris-HCl緩沖液提取,并將提取液經(jīng)SephadexG75柱進(jìn)行凝膠層析,對(duì)洗脫液進(jìn)行紫外吸收測定并同步進(jìn)行Cd、Pb濃度分析,其結(jié)果示于圖1.由圖1看出,糙米的Tris-HCl可溶性組分經(jīng)SephadexG75柱分離得到3個(gè)明顯的紫外吸收峰,分別出現(xiàn)在洗脫液第15管(1峰)、31管(2峰)和44管(3峰)處.經(jīng)與相同條件下的蛋白質(zhì)曲線對(duì)照這3個(gè)峰的表觀分子量分別為54.5KD、16.04KD和5.5KD.從洗脫液中Cd、Pb的濃度分布看,出現(xiàn)了2個(gè)明顯的Cd、Pb峰,其出現(xiàn)位置恰與第1、3個(gè)紫外吸收峰相重合,第2紫外吸收處也有少量Cd、Pb分布.由此推斷,糙米中Cd、Pb蛋白質(zhì)(多肽)結(jié)合體的表觀分子量為54.5KD和5.5KD.2.2cd、pb的濃度變化圖2為蒸煮后的水稻籽實(shí)Tris-HCl提取液的凝膠層析結(jié)果.與對(duì)照比較(圖1),蒸煮后的洗脫液中原有的3個(gè)蛋白質(zhì)紫外峰的OD值都明顯變小,特別第1峰下降明顯,在第3峰后原來沒有紫外吸收的地方也出現(xiàn)了紫外吸收.同時(shí),洗脫液中Cd、Pb的濃度峰也有明顯的變化,原來對(duì)照組中出現(xiàn)的2個(gè)明顯的Cd、Pb濃度峰在蒸煮加熱后不明顯,在1到3峰之間的洗脫液中Cd、Pb的濃度都較低.而在第3峰之后新出現(xiàn)紫外吸收的洗脫液中檢測到較高的Cd、Pb濃度.稻米經(jīng)過蒸煮加熱變成米飯,由于加熱的作用會(huì)使稻米里的蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性,使稻米中存在的天然蛋白質(zhì)分子的二、三級(jí)以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或破壞,通常蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵不會(huì)改變,即組成成分和分子量應(yīng)該沒有改變.圖2中的結(jié)果有可能是蒸煮加熱引起蛋白質(zhì)的凝結(jié),變成了不可溶物質(zhì),因此不能透過凝膠柱,使蛋白質(zhì)1、2峰消失.也有可能一部分大分子的蛋白質(zhì)-Cd、Pb結(jié)合體被破壞,或者分解變成蛋白質(zhì)小分子或多肽,與蛋白質(zhì)結(jié)合的Cd、Pb也被部分地釋放出來.2.3洗脫液中cd和pb濃度的變化圖3為水稻籽實(shí)蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶消化后的凝膠層析結(jié)果.在胃蛋白酶的作用下,洗脫液的蛋白質(zhì)紫外吸收峰發(fā)生了改變,第1個(gè)紫外吸收峰的OD值明顯低于未加酶的對(duì)照組,而第2、3峰的OD值沒有明顯的變化.洗脫液中Cd、Pb的濃度分布也發(fā)生了改變,在第1、3峰處Cd的濃度明顯降低,第1峰處Pb的濃度也明顯降低,但第3峰處Pb的濃度變化不明顯;另外,在第3峰之后的洗脫液中沒有紫外吸收但可見Cd、Pb的濃度分布,可以推斷是由第1峰蛋白質(zhì)-重金屬結(jié)合體分解所形成的,為一些小分子的肽類結(jié)合或游離的金屬離子.從上述洗脫液的OD值和Cd、Pb濃度變化情況看,胃蛋白酶主要對(duì)分子量為54.5KD的蛋白質(zhì)-Cd、Pb結(jié)合體(第1峰)發(fā)生作用.從第3峰處Cd的濃度下降,說明胃蛋白酶對(duì)分子量為5.5KD的蛋白質(zhì)-Cd結(jié)合體有一定的影響,而對(duì)5.5KD的蛋白質(zhì)-Pb結(jié)合體影響不大.2.4cd分布的變化水稻籽實(shí)蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶消化后的凝膠層析結(jié)果見圖4.在胰蛋白酶作用下,洗脫液的第1紫外吸收峰完全消失,第2、3峰的OD值與對(duì)照比較基本上沒有改變.洗脫液第1、3峰處Cd、的濃度明顯下降,第3峰之后的洗脫液中也有少量Cd的分布;洗脫液中Pb的分布與Cd有所不同,在第1峰處沒有Pb的分布,在第2峰處Pb的濃度與對(duì)照差不多,第3峰處及之后的洗脫液中含有較高的Pb濃度.與上述胃蛋白酶消化結(jié)果比較,胰蛋白酶對(duì)分子量為54.5KD的蛋白質(zhì)-Cd、Pb結(jié)合體分解得更徹底.對(duì)分子量為5.5KD的蛋白質(zhì)-Cd結(jié)合體影響也比較大,而對(duì)蛋白質(zhì)-Pb結(jié)合體的影響相對(duì)小些.這說明不同重金屬元素和不同分子量蛋白質(zhì)之間所形成的結(jié)合形態(tài)及其穩(wěn)定性都存在一定的差異,其原因有待進(jìn)一步研究.2.5半胱氨酸形態(tài)cd對(duì)大鼠腸道重金屬含量的影響動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)表明,老鼠口服單一氯化鎘的LD50為204.2mg/kg,而同時(shí)口服L-半胱氨酸(1500mg/kg)和氯化鎘時(shí)的LD50為56.3mg/kg.另外,在半胱氨酸存在下口服氯化鎘,增加老鼠器官中鎘的積累量,這些說明不同形態(tài)的Cd對(duì)動(dòng)物具有不同的毒性.動(dòng)物及人體消化道內(nèi)存在的胃蛋白酶主要水解芳香族或其它疏水氨基酸的羧基或氨基形成的肽鍵,胰蛋白酶只專一性地水解賴、精氨酸的羧基形成的肽鍵.根據(jù)本文的研究結(jié)果,水稻籽實(shí)中的Cd、Pb主要以蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在,經(jīng)過蒸煮和消化酶的作用后主要以小分子的結(jié)合形態(tài)存在,它們對(duì)動(dòng)物和人體的毒性是增強(qiáng)或減弱,還缺乏毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),有待進(jìn)一步研究證實(shí).3對(duì)水稻籽實(shí)中蛋白質(zhì)-cd、pb結(jié)合體的破壞通過凝膠層析方法對(duì)水稻籽實(shí)中的蛋白質(zhì)-Cd、Pb結(jié)合體的分析,結(jié)果表明:水稻籽實(shí)中存在的蛋白質(zhì)-Cd、Pb結(jié)合體的表觀分子量分別為54.5KD和5.5KD.