微量dna檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展與展望

微量dna檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展與展望

在現(xiàn)代犯罪中，現(xiàn)場收集的證據(jù)顯示了多樣性和微小河的發(fā)展趨勢。隨著DNA檢驗(yàn)鑒定技術(shù)的日益完善,檢驗(yàn)的靈敏度也顯著提高,使微量DNA的檢驗(yàn)(LowCopyNumber,LCN)從微克級發(fā)展到納克級以下的水平,小于100pgDNA也可成功分析,這大大提高了其對微量、降解DNA的分析能力。對微量DNA進(jìn)行檢驗(yàn)?zāi)芰Φ奶岣?拓寬了DNA檢驗(yàn)的范圍,使得許多潛在的DNA檢材在偵查破案中發(fā)揮應(yīng)有的價(jià)值,成為破案的直接證據(jù)。我國法醫(yī)DNA技術(shù)的發(fā)展道路不是很長,但卻取得了突出的成果,在偵查破案中發(fā)揮了巨大的作用。從1987年起,我國正式立項(xiàng)對DNA指紋技術(shù)進(jìn)行研究,經(jīng)過兩年的努力,至1989年我國首次把DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于辦案。隨著DNA指紋技術(shù)的不斷應(yīng)用,技術(shù)人員越來越感到其不能滿足實(shí)際工作的需要,存在許多不足之處。進(jìn)入“九五”期間,我國法醫(yī)DNA檢驗(yàn)技術(shù)又有了新的發(fā)展,除了對一些疑難檢材(如骨骼等)的檢驗(yàn)進(jìn)行研究外,商品化DNA檢驗(yàn)試劑盒的出現(xiàn),使DNA檢驗(yàn)技術(shù)更加規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化,尤其是STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用,使DNA檢驗(yàn)技術(shù)步入了新的階段。此外,我國在DNA試劑研制方面也取得了重大突破。目前,公安部物證鑒定中心已研制出DNATyperTM15試劑盒,該試劑盒的靈敏度、隨機(jī)匹配概率、累積非父排除率等性能指標(biāo)達(dá)到了國際先進(jìn)水平。它的成功研制,及其在案件檢驗(yàn)與DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)中的成功應(yīng)用,對于大幅降低DNA檢驗(yàn)成本、消除瓶頸制約、促進(jìn)我國DNA技術(shù)的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的影響和戰(zhàn)略意義。在檢測方法上,也從銀染法人工染色、肉眼觀察分析結(jié)果發(fā)展到熒光法自動電泳收集、計(jì)算機(jī)分析結(jié)果,一次檢驗(yàn)分析的STR多態(tài)性位點(diǎn)顯著增多,大大提高了個(gè)體識別率,達(dá)到了同一認(rèn)定的水平。由于STR的擴(kuò)增片段較短、擴(kuò)增條件類似,能夠在同一體系中進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增,一次檢驗(yàn)就獲得較多的多態(tài)性信息,使微量DNA檢驗(yàn)成為可能。目前我國微量DNA檢驗(yàn)技術(shù)在國際上處于先進(jìn)水平。在文中,筆者對微量DNA技術(shù)的基本應(yīng)用程序作了詳細(xì)論述,并對未來階段的發(fā)展作出了簡要展望。一、克氏原螯蝦生物樣品的采集隨著犯罪分子反偵查手段的日益提高,現(xiàn)場明顯可見的生物物證(如精斑、血斑、毛發(fā)、人體組織等)常被犯罪分子銷毀和破壞。與可以肉眼勘查到的大量生物物證相比,微量生物物證具有體積小、較為隱蔽、不易察覺、不易毀滅等特點(diǎn)。因此,正確認(rèn)識微量生物物證的形成規(guī)律,充分掌握微量生物物證的發(fā)現(xiàn)和采集方法,成為技術(shù)破案成敗的關(guān)鍵。人體新陳代謝時(shí)刻在進(jìn)行,新舊細(xì)胞的更替不受人的意志所控制。所以只要犯罪分子到過現(xiàn)場,就會或多或少遺留下脫落細(xì)胞,如遺留在煙蒂、飲料瓶(罐)、果核、口香糖、筷子、湯匙、牙簽、吸管、郵票、牙刷、咬痕、口罩、面罩上的口腔脫落上皮細(xì)胞;遺留在電話、門鈴、門把手、圍巾、手套、衣物、帽子、襪子、拖鞋、鑰匙、刀柄、汽車方向盤、筆桿、手表、眼鏡、耳勺、指紋上的皮膚(體表)脫落上皮細(xì)胞;以及遺留在現(xiàn)場的尿液、糞便、鼻涕內(nèi)的粘膜脫落上皮細(xì)胞等等。皮膚是人體最大的器官,重量約占人體體重的15%,其表皮細(xì)胞的平均壽命為一個(gè)月左右,每天脫落的細(xì)胞就達(dá)400000個(gè)。因此,皮膚表面就是一個(gè)巨大、潛在的生物物證來源,現(xiàn)場能存留皮膚脫落上皮細(xì)胞的可能性也最大。對于這些潛在的微量生物物證,一旦成功獲得了關(guān)鍵物證的DNA分型,往往就能成為案件偵破的關(guān)鍵線索,并為案件定性及法庭量刑提供科學(xué)證據(jù)。采集微量DNA樣本時(shí),首先要觀察檢材哪些部位是與犯罪嫌疑人皮膚、口腔等接觸多或易留下細(xì)胞的施力部位。其次,不同的接觸面要采用不同的轉(zhuǎn)移方法。對于接觸面積比較大、比較光滑的接觸面,一般采用棉簽擦拭的方法轉(zhuǎn)移;對于表面比較粗糙的接觸面,通?？刹捎脼V紙或棉線分部位擦拭的方法轉(zhuǎn)移。利用公安部物證鑒定中心研制的生物脫落細(xì)胞提取儀,可以將結(jié)合松散的脫落細(xì)胞聚集到濾膜上,一方面使脫落細(xì)胞集中,另一方面保持檢材的完整,做到無損提取。公安部物證鑒定中心研制的另外一款脫落細(xì)胞提取裝置EZ-tape采用tape-lifting技術(shù)設(shè)計(jì),具有攜帶方便、操作簡單的優(yōu)點(diǎn),并且可針對重點(diǎn)部位進(jìn)行粘取,有效避免了物證提取、保存過程中的污染。另外,近幾年興起的顯微激光捕獲技術(shù)可以選擇性地捕獲單個(gè)目的細(xì)胞。二、微量dna的提取如何從微量檢材中提取到足夠的DNA,以滿足法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的需要,選擇合適的提取方法非常關(guān)鍵,這是法醫(yī)物證檢驗(yàn)工作者最關(guān)注的難題之一。與常規(guī)生物檢材如血痕、精斑相比,微量DNA檢材屬于疑難生物檢材。首先,肉眼觀察很難判斷微量細(xì)胞在載體上的具體部位,盲目提取難以獲得所需靶細(xì)胞;其次,擦拭面積太大會降低靶DNA的濃度,并帶來外源物質(zhì)的污染和干擾;第三,微量DNA檢材含量僅相當(dāng)于15個(gè)雙倍體或30個(gè)單倍體細(xì)胞的生物樣本,因此需要制定科學(xué)、系統(tǒng)的提取方案,以保證檢驗(yàn)的成功率。在提取過程中,一是要注意防止污染,一定要將微量DNA檢材和常量物證及人員樣本分開提取,嚴(yán)格防范在現(xiàn)場勘查或送檢過程中可能造成的檢材污染,盡可能將相關(guān)人員的DNA數(shù)據(jù)放入質(zhì)控庫。嚴(yán)格執(zhí)行《法庭科學(xué)DNA檢驗(yàn)規(guī)范操作標(biāo)準(zhǔn)》(GA/T383-2002),避免實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染,并同時(shí)設(shè)置陰性、陽性對照來監(jiān)測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠程度;二是要盡量少處理和觸摸所要擦拭的區(qū)域,以防止本來已經(jīng)轉(zhuǎn)移下來的細(xì)胞又被重新轉(zhuǎn)移回去;三是如果檢材可能有多人接觸過,應(yīng)當(dāng)分區(qū)域進(jìn)行檢材的提取,以防止人為造成DNA樣本的混合,增加檢驗(yàn)難度。目前常用的微量DNA提取方法包括Chelex法、磁珠法、硅珠法、Microcon過柱法等。Chelex法提取DNA,操作簡單快速,整個(gè)提取過程均在一個(gè)離心管中進(jìn)行,避免了DNA在提取過程中的損耗,對污染輕、雜質(zhì)少的微量DNA檢材,用Chelex法提取最為方便快捷。但Chelex法不能去除DNA溶液中的雜質(zhì)和降解的DNA碎片。因此,對用Chelex法提取的陳舊微量檢材的DNA進(jìn)行STR擴(kuò)增時(shí),即使模板量在試劑盒推薦的范圍內(nèi),也容易出現(xiàn)等位基因擴(kuò)增不平衡的現(xiàn)象。硅珠法和磁珠法與Chelex法相比,雖然提取過程中會造成部分DNA的損失,但提取的DNA純度高,能有效去除100bp以下的DNA小片段和樣品中的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。因此,STR擴(kuò)增時(shí)峰高比較均衡,等位基因擴(kuò)增不平衡的現(xiàn)象不明顯。另外,硅珠法和磁珠法避免了有機(jī)溶劑對操作者的潛在危害,操作簡單、耗時(shí)短。因此,更適合微量、污染檢材的DNA提取及自動化操作。Microcon過柱法操作簡單,適合污染微量DNA的純化濃縮。磁珠法提取DNA試劑盒是納米技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)技術(shù)和法醫(yī)學(xué)技術(shù)的綜合產(chǎn)品。納米材料具有小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng),能夠用于高效DNA提取,滿足微量生物樣本DNA提取的要求。實(shí)驗(yàn)表明,即使是0.5μL血仍能得到DNA分型,甚至當(dāng)溶液中DNA含量僅為100pg時(shí),DNA回收率仍然達(dá)到90%以上。硅珠法是在高濃度硫氰酸胍的存在下,DNA被二氧化硅特異性的吸附。被吸附的DNA在沒有硫氰酸胍存在下,DNA又從二氧化硅中釋放出來。硫氰酸胍是高性能的蛋白變性劑,可以使蛋白與DNA分離,在硅珠吸附前高速離心可以將變性的蛋白質(zhì)等不溶物除去。吸附后的漂洗可將溶液中的PCR抑制物除去。因此提取的DNA比較純、回收率高。根據(jù)微量檢材DNA含量的多少,加入適當(dāng)?shù)南疵撘?就可以獲得高純度和相對高濃度的DNA模板。對于接觸時(shí)間短、細(xì)胞殘留少且分散的檢材,也可以剪取較多載體,分多管用Chelex-100法提取消化,收集多管上清液,再用硅珠進(jìn)行純化,以提高DNA模板的純度和濃度。三、提高pcr檢測結(jié)果PCR技術(shù)解決了微量DNA的檢測鑒定問題。對微量DNA的擴(kuò)增可通過以下方法來提高檢驗(yàn)的成功率:(1)增加循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)可由28增加至32~34,以提高擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。Gill等使用34個(gè)循環(huán)體系,擴(kuò)增模板量為0.025ng(相當(dāng)于4個(gè)細(xì)胞核)的DNA,得到了完全的DNA圖譜。(2)增加模板DNA的用量,并相應(yīng)減少反應(yīng)體系中水的比例,以增加擴(kuò)增時(shí)模板DNA的相對濃度。(3)使用針對降解DNA和微量DNA設(shè)計(jì)的minFilerTM試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。另外,電泳檢測時(shí)增大電泳儀進(jìn)樣電壓和(或)延長進(jìn)樣時(shí)間,也可提高檢驗(yàn)的成功率。近年來,有學(xué)者采用多重置換擴(kuò)增(MultipleDisplacementAmplification,MDA)技術(shù),對不同模板量DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WholeGenomeAmplification,WGA)。擴(kuò)增產(chǎn)物用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量,并用成品試劑盒檢測基因型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可對模板DNA增加104~106倍。低于0.1ng的樣品DNA經(jīng)MDA擴(kuò)增后,基因座檢出數(shù)增加,但可見等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象,說明MDA技術(shù)可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果,可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)人識別領(lǐng)域。由于微量DNA的模板量相對較少,檢測結(jié)果可能會產(chǎn)生不對稱擴(kuò)增、等位基因的丟失或增加等問題,分析時(shí)應(yīng)注意,并慎重判斷。當(dāng)峰值較低時(shí),應(yīng)該重復(fù)實(shí)驗(yàn)。四、檢測新生兒成分的方法當(dāng)用于分析的樣本DNA含量極其有限時(shí),稍有遺損就可能導(dǎo)致無法成功檢測,或者沒有足夠的樣本DNA來滿足再次檢測的需要。因此,如何充分獲得極其微量的DNA樣本并進(jìn)行準(zhǔn)確的分型,成為目前國內(nèi)外相關(guān)學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)之一。為此,國內(nèi)外的生物公司試圖研發(fā)一些經(jīng)濟(jì)、簡便、快速的檢測手段以應(yīng)對法醫(yī)DNA檢驗(yàn)存在的疑難問題。比如在日常檢案中,混合檢材的問題一直困擾著法醫(yī)DNA檢測人員,如混合斑中精子DNA的分型,雖然可以通過兩步法提取去除女性成分的干擾,或通過Y-STR的檢測達(dá)到檢測男性成分的目的,但檢測效果有時(shí)不理想?；蛉缭缙诮K止妊娠的胚胎組織,母體成分與胎兒成分的分離檢測,也一直是檢測的難點(diǎn)。有研究者采用手工顯微切割技術(shù)分離流產(chǎn)組織中的胎兒成分,雖然獲得成功,但手工顯微切割不僅耗費(fèi)人力,而且精度難以保證,不能完全去除母親成分的污染。美國NIHLitta實(shí)驗(yàn)室開發(fā)并不斷完善的激光捕獲顯微切割(LaserCaptureMicrodissection,LCM)技術(shù),可在顯微鏡下利用激光從組織切片或細(xì)胞涂片中俘獲并切割單一類型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞。STR的靈敏性與LCM技術(shù)的特異性捕獲相結(jié)合,在很大程度上解決了以上問題。鑒于微量DNA檢材種類的繁多,從載體上獲得微量DNA的含量和純度受個(gè)體差異(如當(dāng)事人的皮膚性質(zhì)、皮膚清潔情況、代謝狀況等)、與載體接觸時(shí)間、接觸力度、載體性質(zhì)、同時(shí)存在的PCR抑制劑種