小麥東農(nóng)和大麥種植酸酶的活性測(cè)定

小麥東農(nóng)和大麥種植酸酶的活性測(cè)定

許多植物種子和加工副產(chǎn)品含有天然植酸酶，但不同類型和品種的植物之間存在較大差異（bartnik等人，1987）。麥類籽實(shí)中如小麥、大麥、小黑麥、黑麥等具有較高植酸酶活性,而玉米、高梁、油菜籽中的植酸酶活性很低(韓延明等,1995;Eeckhout等,1994;Pointillart1993)。植物植酸酶的最適pH為4.0～6.0,適宜溫度為45℃～60℃(Eeckhout等,1994;Reddy等,1982),但對(duì)不同種類植物中植酸酶特性尚缺乏系統(tǒng)的研究。一些研究證實(shí),高植酸酶活性的植物性飼料中磷的利用率較高Nelson,1980),而且,植物中的植酸酶能夠在飼料中發(fā)揮作用,提高飼糧中磷的利用率(韓延明等,1995;Newton等,1983;Scheuermann等,1988;Pointillart,1991;Barrier-Guillot等,1996)。如能合理利用植物性飼料中的這部分植酸酶,植物將是植酸酶的最廉價(jià)的來源,因?yàn)?它本身即為植物性飼料中的天然成分,不需要額外的增加成本。但是,植物性飼料中天然植酸酶活性很低,提高其活性是開發(fā)利用這部分植酸酶的關(guān)鍵步驟。研究表明,當(dāng)種子吸水萌發(fā)時(shí),植酸酶活性迅速增強(qiáng)(傅啟高,1998;盧良恕,1996;劉迅等,1998)。因此,有希望通過發(fā)芽提高植物籽實(shí)中植酸酶活性,直接利用發(fā)芽飼料或從中提取植酸酶因此,本試驗(yàn)的目的在于研究發(fā)芽對(duì)麥類籽實(shí)中植酸酶活性的提高程度及麥類籽實(shí)中植酸酶的適宜溫度和pH范圍,探討其在飼料中應(yīng)用的可行性。1材料和方法1.1農(nóng)學(xué)種植及小黑麥加工小麥東農(nóng)123(WheatNEAU123)、小麥東農(nóng)973821(WheatNEAU973821)、大麥墾啤2號(hào)(BarleyK2)、小黑麥92021(Triticale92021)、小黑麥5305(Triticale5305)及黑麥2號(hào)(Rye2),均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。1.2植酸粗酶液的提取風(fēng)干樣粉碎過0.25mm(60目)篩,用醋酸鈉緩沖液(0.25mol/L,pH=5.50)攪拌抽提1小時(shí),過濾,所得濾液定容即為植酸粗酶溶液。鮮麥芽先勻漿,其他步驟與上述相同。測(cè)定方法參照張若寒(1997)、陸文清等(2000)介紹的方法。植酸酶的含量以酶活性單位表示。1植酸酶單位定義為:在37℃、pH5.5的條件下,1分鐘內(nèi)從0.0051mol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol無(wú)機(jī)磷所需要的植酸酶量。1.3保濕和保濕液制備將100g左右風(fēng)凈的種子放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿,厚度以不超過2cm為宜。加入蒸餾水,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱。每天澆水4次。分別于發(fā)芽第1、2、3、4、5、6天取樣測(cè)其中酶活和干物質(zhì)含量。1.4不同因素對(duì)植酸酶活性的影響以小黑麥5305為代表,固定底物pH值為6.0、5.5、5.0,調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,分別測(cè)定其中植酸酶的活性。固定反應(yīng)溫度于37℃、55℃,調(diào)節(jié)底物pH值為8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.02.5、1.5,分別測(cè)定其中植酸酶的活性。1.5數(shù)據(jù)分析所得數(shù)據(jù)用SAS6.12軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以“X±SE”表示,其中n=4。2結(jié)果2.1不同發(fā)芽時(shí)間、不同小麥、天麻發(fā)芽能夠提高麥類籽實(shí)中植酸酶的活性,見表1。從表中可以看出,麥芽中植酸酶的活性與發(fā)芽時(shí)間密切相關(guān),隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),但不同麥類的籽實(shí)植酸酶活性達(dá)到最高點(diǎn)所需的發(fā)芽時(shí)間不同。小黑麥和黑麥在發(fā)芽第1天麥芽中植酸酶的活性最高,絕干基礎(chǔ)植酸酶活性與未發(fā)芽前相比差異極顯著(P<0.01),此后即隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降;小麥、大麥麥芽中植酸酶活性在第3天才達(dá)到最強(qiáng)。不同種類、品種的麥類發(fā)芽過程中植酸酶提高的程度不同。以干物質(zhì)基礎(chǔ)酶活達(dá)到最高點(diǎn)計(jì)算,與未發(fā)芽前相比,小麥東農(nóng)123、小麥東農(nóng)973821、大麥墾啤2號(hào)、小黑麥92021、小黑麥5305、黑麥2號(hào)麥芽中植酸酶活性分別增加到2.04、2.55、4.63、1.36、1.82和2.45倍。2.2不同ph值對(duì)植酸酶活性的影響植酸酶和其它酶一樣,其活性受溫度的影響,結(jié)果見圖1。從圖中可以直觀地看出,在一定溫度范圍內(nèi),植酸酶活性隨溫度升高而升高,甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過標(biāo)準(zhǔn)條件下的酶活性,達(dá)到一定臨界溫度后,植酸酶的活性迅速下降,呈現(xiàn)出鐘形曲線。在50℃處,植酸酶活性最大,在40℃～60℃范圍內(nèi)可保持較高的酶活。表現(xiàn)最大酶活的溫度點(diǎn)與反應(yīng)體系的pH值有關(guān),隨pH值的降低,整個(gè)酶活—溫度曲線右移,即在較低pH條件下,植酸酶的耐熱性能提高。當(dāng)pH為6.0時(shí),在45℃處具有最大活性,而當(dāng)pH變?yōu)?.5、5.0時(shí),則分別在50℃、55℃處酶活性最高,但pH為5.5時(shí)植酸酶的最大酶活高于其它pH條件下的最大酶活。2.3麥類籽實(shí)中植酸酶的最適phpH值與植酸酶活性的關(guān)系亦表現(xiàn)為典型的鐘形曲線,在pH5.5處酶活性最大(圖2)。麥類籽實(shí)中植酸酶pH范圍很窄,僅在4.5～6.5之間具有較高活性,pH低于4.0或高于7.0時(shí),植酸酶的活性幾乎完全喪失。溫度升高使植酸酶的適宜pH降低。溫度與pH對(duì)植酸酶活性的影響表現(xiàn)出互作效應(yīng)。3討論3.1不同發(fā)芽時(shí)間對(duì)植酸酶活性的影響植物種子中存在的植酸酶在干燥狀態(tài)下不表現(xiàn)活性,當(dāng)種子吸水開始發(fā)芽時(shí)期,植酸酶被激活并水解植酸鹽,釋放出無(wú)機(jī)磷供作物生長(zhǎng),因此發(fā)芽可以增加種子中植酸酶活性。植酸酶的活性一般隨萌發(fā)時(shí)間增加而增強(qiáng),在小麥種子中植酸酶活性每千克干種子為680U,吸水第一天為930U,第二天為1400U,第三天為2120U。萵苣種子萌發(fā)72小時(shí)后植酸酶的活性增大6倍。大豆發(fā)芽5天后,植酸酶活性提高2.27倍,Dwarf灰豆和Alaska豆分別提高8.07倍和37.56倍(博啟高,1998)。大麥在籽粒萌發(fā)期間,植酸酶活性可增至原來的8倍左右(盧良恕,1996)。本試驗(yàn)的結(jié)果也顯示,麥類籽實(shí)發(fā)芽后植酸酶活性極顯著高于發(fā)芽前(P<0.01),但提高程度均低于上述報(bào)道,大麥發(fā)芽后植酸酶活性提高的程度最大,也僅為原來的4.63倍。研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn),發(fā)芽后植酸酶活性達(dá)到最大值所需的時(shí)間也低于其他研究者報(bào)道的發(fā)芽天數(shù)?？梢娭参锲贩N、發(fā)芽條件影響植酸酶活性的提高程度。本研究中,發(fā)芽對(duì)植酸酶活性提高程度有限,遠(yuǎn)低于前人的報(bào)道。今后尚需進(jìn)一步選擇適宜的品種,優(yōu)化發(fā)芽條件。植酸酶活性在發(fā)芽期間呈現(xiàn)先增高然后有逐漸降低的趨勢(shì),劉訊等(1998)在研究玉米和番茄種子發(fā)芽期間植酸酶活性變化時(shí)也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。作者認(rèn)為,在種子萌發(fā)后期,因貯藏態(tài)養(yǎng)分耗盡,植酸酶的合成降低。種子萌發(fā)的物質(zhì)效率較低,種子的干物質(zhì)損失很大。因此,需選取適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn),優(yōu)化植酸酶和干物質(zhì)之間的關(guān)系,以獲得最佳效益。3.2不同ph對(duì)植酸酶活性的影響植物植酸酶的最適pH為4.0～6.0,在pH3.0時(shí)活性顯著下降甚至完全失活(Eeckhout等,1994)。Peers等(1953)發(fā)現(xiàn)來源于小麥的植酸酶最適pH為5.15,最適溫度為55℃。Reddy等(1982)認(rèn)為植物植酸酶最適pH為5.0,適宜溫度為45℃～60℃。Gibson和Ullah(1990)研究了大豆植酸酶的性質(zhì),其適宜的pH是4.5～4.8,當(dāng)pH為6以上時(shí),活性迅速下降;適宜的溫度是50℃,在60℃時(shí)發(fā)生變性。張暉等(1998)對(duì)小麥麩中植酸酶性質(zhì)進(jìn)行了研究,其最適溫度為55℃,最適pH為5.2,當(dāng)pH值為4或6時(shí),酶的活力下降了近一半。本試驗(yàn)研究了小黑麥5305中植酸酶的性質(zhì),試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道基本一致。適宜溫度為50℃,在40℃～60℃范圍內(nèi)可保持較高的酶活;適宜pH為5.5,低于4.0或高于7.0,活性基本喪失。單胃動(dòng)物胃中pH一般為1.5～3.5,小腸pH為5～6,小腸中的酸堿環(huán)境適合植物性植酸酶發(fā)揮作用。植物植酸酶在籽實(shí)中呈結(jié)合態(tài)存在,是否能夠經(jīng)受住胃中低pH的破壞作用,到達(dá)小腸中再發(fā)揮作用,有待于進(jìn)一步研究。家禽嗉囊中pH在4.39～4.82之間,溫度約為40℃,而且飲水可將飼料濕潤(rùn)和軟化并激活植酸酶活性,另外,飼料在此處與植酸酶均勻混合,停留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)(宋金彩,2000),因此嗉囊中的環(huán)境適合植酸酶的作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),溫度和pH對(duì)酶活性的影響存在著互作效應(yīng)。降低pH能提高植物植酸酶對(duì)熱的相對(duì)穩(wěn)定性,而提高