納豆激酶分離純化的雙水相工藝研究

納豆激酶分離純化的雙水相工藝研究

1金屬螯合雙水相鄰和分配技術(shù)imap納豆激酶（nk）是納豆糖酶（ba細(xì)胞沙脂菌）產(chǎn)生的一種絲綢氨酸酶。具有誘導(dǎo)纖溶活性和溶脹性，可治療和預(yù)防血栓形成疾病。還可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的tpa，以提高溶脹能力。納豆激酶來源廣泛、價廉易得,溶栓活性高、特異性強(qiáng),是一種很有前途的新一代抗栓藥物。常規(guī)的分離流程為:發(fā)酵液離心,硫酸銨分級沉淀后進(jìn)行SephadexG-75凝膠層析,NK回收率74.3%,純化倍數(shù)4.75。還有用擴(kuò)張床吸附層析來進(jìn)行NK的初步純化,具有較好的效果。金屬螯合雙水相親和分配技術(shù)(IMAP)把金屬螯合親和作用引入雙水相分配,具有選擇性好、分離條件溫和、與生物質(zhì)兼容性好等優(yōu)點而倍受關(guān)注。對于表面具有His-X3-His、His-Gly-His等位點的天然蛋白質(zhì)或帶有組氨酸標(biāo)簽的基因工程蛋白具有高度的親和作用。納豆激酶是由275個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,氨基酸一級序列結(jié)構(gòu)中存在-H(64)GTH(67)-結(jié)構(gòu),可以考慮應(yīng)用IMAP技術(shù)進(jìn)行分離。本文擬采用IMAP技術(shù)對納豆激酶進(jìn)行粗分離,通過對聚合物的分子量、濃度、親和配基加入量、溶液的pH值、相比以及生物質(zhì)加入量等因素的考察,優(yōu)化納豆激酶IMAP分離的工藝參數(shù)。2實驗材料和方法2.1其它試劑的制備PEG-IDA-Cu(II)由本實驗室制備,聚乙二醇(PEG,浙江衢化集團(tuán)),羥丙基淀粉(PES,瑞典CarbamylAB公司),其它試劑均為市售分析純。納豆激酶產(chǎn)生菌為BacillussubtilisHL-1,由浙江大學(xué)生物工程研究所篩選獲得,分離用發(fā)酵液由3.7L發(fā)酵罐(Bioengineering)培養(yǎng)得到。培養(yǎng)基組成為(g?L-1):胰蛋白胨,22.7;木糖,20;Na2HPO4,5.37;NaH2PO4,1;CaCl2,0.2;MgSO4,0.5;pH,7.0。發(fā)酵液調(diào)pH為8.0,保藏于4備用。2.2實驗方法2.2.1分析納豆激酶酶活測定采用纖維蛋白瓊脂糖凝膠平板法。蛋白質(zhì)濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)法。2.2.2發(fā)酵液體系的配制雙水相系統(tǒng)在室溫下配制,系統(tǒng)總重5g,各組分的濃度均用質(zhì)量百分比表示。將PEG、PES和無機(jī)鹽配制成一定濃度的母液,按預(yù)先設(shè)計好的總組成,精確稱量,配制成相應(yīng)的雙水相系統(tǒng),加入一定量的發(fā)酵液、緩沖液補(bǔ)足至5g,封口,上下顛倒數(shù)次,混勻后,1000r?min-1離心5分鐘使其分相。測定上下相體積,取樣,分析上下相中NK及總蛋白含量。文中NK的分配系數(shù)Ke,蛋白質(zhì)分配系數(shù)Kp,相比R分別表示上下兩相間酶活、總蛋白和相體積的比值;Ye和Yp則分別為上相中納豆激酶和總蛋白的收率,純化因子(P.F.)為Ye和Yp的比值。2.3水相系統(tǒng)分配的選擇性雙水相萃取具有可以直接處理發(fā)酵液的優(yōu)勢,把金屬螯合親和作用引入雙水相系統(tǒng)加強(qiáng)了分配的選擇性,也給原本影響因素就比較多的雙水相分配增添了研究難度。圖1示意了金屬螯合雙水相親和分配的過程開發(fā),本文對圖中的各影響因素進(jìn)行比較系統(tǒng)的研究,以逐步尋求分離條件的優(yōu)化。3結(jié)果和討論3.1酶活性研究3.1.1溫度對24h酶活的影響實驗表明,在25～37范圍內(nèi),NK酶活相對穩(wěn)定,當(dāng)溫度超過45時,酶活逐漸喪失,當(dāng)溫度超過60,則因蛋白質(zhì)變性而迅速失活。在37下,24h酶活仍可保持在95%以上,結(jié)果如圖2所示。本實驗于室溫下進(jìn)行,故可忽略溫度對酶活損失的影響。3.1.2不同ph值對納豆激酶酶活的影響酶對環(huán)境pH值的敏感程度也是分離中必須考慮的一個重要因素,這里以NaOH或HCl來調(diào)節(jié)系統(tǒng)的pH值,分別考察pH對納豆激酶酶活的影響。分別將含有NK的樣品放置在試管內(nèi),調(diào)節(jié)pH值,其中部分樣品在調(diào)到要求的pH后,馬上就測定其酶活(記為0h)、而部分樣品在不同pH環(huán)境中放置12h,再測各管中納豆激酶的酶活。同時將放置12h后的樣品,重新調(diào)節(jié)到納豆激酶的適宜pH值(取7.8),再放置12h,測定酶活,結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果表明,在pH5.0～11.5之間,酶活都能保持在1100U·mL-1以上;但放置時間較長,如12h,當(dāng)pH降至6.5以下時,酶活明顯降低;但是,當(dāng)pH調(diào)回7.8時,酶活能基本恢復(fù)到初始狀態(tài)。3.1.3聚合物對酶活的影響考察了雙水相成相聚合物PEG、PES以及親和配基PEG-IDA-Cu(II)的存在對酶活的影響,由圖4可見,成相物質(zhì)的存在對酶活沒有明顯抑制作用,即使達(dá)到了很高的聚合物濃度(40%PEG和30%PES)酶活回收率仍在90%以上,少量聚合物的存在反而對酶活有穩(wěn)定作用。親和配基的存在,對酶活會產(chǎn)生較大的影響,但是在實際使用中,親和配基的使用量很少,一般在5%以下,此時,酶活回收大于90%,即使在最大使用量10%時,酶活回收仍超過80%,所以,實驗中忽略配基的加入對酶活的影響。3.2peg/na2so4系統(tǒng)分配機(jī)制對kePEG和若干無機(jī)鹽會形成雙水相系統(tǒng),不同的系統(tǒng)中金屬配基對目標(biāo)物的親和分離效果也不相同。首先,考察了NK在PEG+PEG-IDA-Cu(Ⅱ)/(NH4)2SO4系統(tǒng)中的分配情況,發(fā)現(xiàn)親和配基的加入并不能提高NK的分配系數(shù)。進(jìn)一步考察了NK在PEG/Na2SO4系統(tǒng)中的分配情況,結(jié)果見表1。PEG/Na2SO4系統(tǒng)中,較低的pH對分配有利,親和配基的加入能顯著提高Ke。但由于Kp較大,雜蛋白也傾向于上相分配,純化因子不高。因此,PEG/無機(jī)鹽系統(tǒng)對NK親和分離不是十分有效。3.3納豆激酶在雙聚合物系統(tǒng)中的分配3.3.1peg分子量的影響考慮到PEG/無機(jī)鹽系統(tǒng)加入親和配基的分離效果不是十分有效,因此改用雙聚合物系統(tǒng)?？疾炝薖EG/PES系統(tǒng)中NK的分配,選擇PES100(分子量100,000)作為一種成相聚合物,考察PEG分子量變化的影響,結(jié)果示于圖5。隨著PEG分子量的減小(從20,000到2,000),NK的分配系數(shù)(Ke)增大。比較可見,PEG2000/PES100系統(tǒng)的Ke較高,但雜蛋白的分配系數(shù)(Kp)也較大,影響了純化因子。因此,為了得到較高的純化因子,選擇PEG4000/PES100系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化。圖5比較了PEG/PES100雙水相系統(tǒng)中PEG濃度對納豆激酶分配的影響,發(fā)現(xiàn)PEG濃度對分配沒有明顯的影響。3.3.2金屬螯合親和配基的分配系數(shù)在PEG4000/PES100系統(tǒng)中,保持PEG總量不變(9%),然后加入不同量的PEG-IDA-Cu(II),以考察不同親和配基濃度對分配的影響,結(jié)果見圖6,其中NK發(fā)酵液加入量固定為5%。隨著系統(tǒng)中PEG-IDA-Cu(II)加入量的增加,NK在雙水相中的分配系數(shù)迅速增加,達(dá)到一個最大值后略有下降,即過多的親和配基反而使分配系數(shù)有所下降。主要原因可能在于金屬螯合親和配基本身在雙水相系統(tǒng)中也有一定的分配,隨著分配于上相的親和配基與目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點逐漸達(dá)到飽和,親和效果逐漸加強(qiáng),表現(xiàn)為分配系數(shù)的增大;當(dāng)親和配基量增加到一定程度后,下相中親和配基積累過多,將導(dǎo)致NK部分向下相轉(zhuǎn)移,分配系數(shù)下降,親和效果降低。3.3.3ph對納豆激酶活性的影響固定系統(tǒng)中親和配基的含量為2%,考察了pH在5～10之間的親和分配情況。由圖7可見:不同PEG分子量的PEG/PES系統(tǒng),Ke隨pH的變化十分明顯,先隨pH的增加而增大,至pH8～9之間出現(xiàn)最大值,之后隨pH增加略有下降?！鱈ogKe=LogKea-LogKeo,Kea和Keo分別代表了親和配基存在和無親和配基時,納豆激酶在上下相的分配系數(shù),由此可以很好地表征親和配基的引入對雙水相系統(tǒng)提高選擇性的貢獻(xiàn)。圖8比較了PEG4000/PES100系統(tǒng)中,無親和配基存在(PEG9%,PES16.7%),及配基含量2%(PEG7%,PEG-IDA-Cu(II)2%,PES16.7%)時,pH對NK和總蛋白分配的影響。由圖可見,親和配基的加入明顯提高了NK的分配系數(shù),而雜蛋白隨pH變化在兩相間分配情況的變化不大。因此,選擇合適的pH(pH8.2)能達(dá)到較好的分離效果。3.3.4配基、發(fā)酵、汁添加量的確定兩相的相比也會對分配產(chǎn)生影響,考察了相比在0.4至4.1(上相/下相)范圍內(nèi),相比對親和分配的影響,結(jié)果見圖9所示,這時,固定親和配基的加入量為2%,發(fā)酵液加入量為5%。由圖9可知,隨著相比的增大,分配系數(shù)變化不大,收率明顯增加,但純化因子有所下降,因此必須綜合考慮收率和純化因子的因素。選擇相比在1左右時,既能得到較高的純化因子,又能保證90%左右的酶活收率。當(dāng)相比為1.2時,系統(tǒng)組成為(w/w):PEG-IDA-Cu(II),2%;PEG4000,7.6%;PES100,20.2%;pH,8.2;發(fā)酵液加入量5%。3.3.5生物質(zhì)加入量對納豆激酶活性的影響為了提高分配過程的處理量,在上述研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了發(fā)酵液加入量對分配的影響。在PEG4000/PES100(PEG+PEG-IDA-Cu(Ⅱ)9.6%,PES20.2%)系統(tǒng)中,當(dāng)發(fā)酵液加入量由2%增至30%,同時按比例提高親和配基的加入量,納豆激酶在上下相的分配情況見圖10。隨著生物質(zhì)加入量的增加,加入量在20%的范圍內(nèi)親和效果略有下降,當(dāng)加入量大于20%,由于蛋白質(zhì)溶解度的限制以及雜蛋白的干擾,分配系數(shù)有較明顯下降。因此,合適的發(fā)酵液加入量為15%。3.3.6系統(tǒng)的分離結(jié)果在上述優(yōu)化條件下,對納豆激酶的雙水相親和分離進(jìn)行了適當(dāng)?shù)姆糯笤囼?系統(tǒng)總量分別增加到50g和100g,其分離結(jié)果示于表2中。由表2的結(jié)果可見,對于親和雙水相系統(tǒng),可以較好地進(jìn)行線性放大。3.3.7減少雜蛋白的分配在一次萃取以后,分離出上相,加入與原下相相同組成和體積的純下相,進(jìn)行再次分配,可進(jìn)一步去除雜蛋白,提高純化因子。二次分配,Ke=16.02,Kp=0.94,Ye=89.42%,P.F.=1.69。因此,經(jīng)過兩次萃取,納豆