雙水相萃取分離果膠酶的研究

雙水相萃取分離果膠酶的研究

雙水相萃取系統(tǒng)通常由兩種水生聚合物或兩種水生聚合物組成，以及由鹽和水組成的三個單相系統(tǒng)。近年來,該萃取技術(shù)受到研究者的青睞,尤其是它對蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物活性物質(zhì)的分離純化等方面受到廣泛重視,雙水相萃取在提取生物活性物質(zhì)方面有如下優(yōu)點:含水量高;分相時間短;界面張力小;不存在有機(jī)溶劑殘留問題;大量雜質(zhì)能與所有固體物質(zhì)一同除去;易于工程放大和連續(xù)操作;更重要的是雙水相萃取避免了傳統(tǒng)液-液萃取中生物活性物質(zhì)與有機(jī)溶劑的直接接觸,保護(hù)了其活性,有研究表明聚合物對顆?；蛏锓肿拥慕Y(jié)構(gòu)不但沒有破壞作用,反而有穩(wěn)定作用。果膠酶在食品、釀酒、環(huán)保、醫(yī)藥、紡織及洗滌劑行業(yè)應(yīng)用十分廣泛。而我國果膠酶的生產(chǎn)技術(shù)很不成熟,提取分離中效率低、酶易失活是要重點解決的問題之一,雙水相萃取技術(shù)用于果膠酶的研究未見文獻(xiàn)報道。因此,本研究對雙水相技術(shù)提取果膠酶進(jìn)行了初探,以PEG/(NH4)2SO4雙水相體系為考察對象,比較了不同濃度的PEG和(NH4)2SO4組成的雙水相體系對果膠酶的萃取效果,并考察了影響萃取效果的各種因素。1材料和方法1.1硫酸銨、dm、d、b、酸鈉、苯酚、酒石酸鈉、苯酚PEG(分子量為400、600、1000)、硫酸銨、DNS、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚,均為市售分析純;果膠粉Sigma公司;果膠酶實驗室保存。1.2精密測試設(shè)備800型離心機(jī)上海手術(shù)器械廠;棱光可見分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司;精密pH計雷磁儀器廠;電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司;FA2104S電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;WH-3微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠。1.3方法1.3.1peg/nh42so4質(zhì)量百分濃度的測定將不同分子量的PEG和(NH4)2SO4制成一定濃度溶液,準(zhǔn)確量取一定量PEG溶液,加入試管中,然后加入(NH4)2SO4溶液,混合至試管開始出現(xiàn)混濁為止,離心分離或靜置分離成相即可得到PEG/(NH4)2SO4雙水相體系,根據(jù)加入的(NH4)2SO4溶液的量,算出PEG和(NH4)2SO4及水在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分濃度。1.3.2萃取分相及酶活力測定參照上述的成相條件,計算雙水相系統(tǒng)所需成相物質(zhì)的量,混勻后用離心刻度試管離心分離使其成相,測定相體積比R(R=Vt/Vb),量取適量體積的酶液,與PEG/(NH4)2SO4雙水相體系混合,在室溫下進(jìn)行萃取分相,分相完全后分別測定上下相中的酶活力。1.3.3酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS比色法)測定果膠酶的酶活性。1.3.4分配系數(shù)的測量分相后上相酶活與下相酶活的比值,以K表示。2結(jié)果與分析2.1peg對果膠酶活性的影響將PEG400、PEG600、PEG1000分別配成質(zhì)量百分濃度為30%的溶液,準(zhǔn)確吸取5ml不同分子量的PEG溶液,分別加入1ml稀釋50倍的酶液,混勻10min,測定不同分子量PEG中的酶活。對照樣用5ml蒸餾水加入1ml稀釋50倍的酶液,以酶活活性比(X)為指標(biāo),考察成相物質(zhì)對酶活性的影響。X按下列公式進(jìn)行計算:實驗結(jié)果表明,在所選定三種PEG中,PEG1000的溶液中酶活活性比最大,說明其對果膠酶活性的影響最小。故選取PEG1000為雙水相系統(tǒng)成相物質(zhì)。2.2萃取相總濃度對產(chǎn)品品質(zhì)的影響用不同濃度的PEG1000構(gòu)成PEG/(NH4)2SO4雙水相體系,分別測定果膠酶在不同的雙水相體系中的分配系數(shù),實驗結(jié)果如表1所示。實驗表明,當(dāng)(NH4)2SO4濃度一定時,隨著PEG1000濃度的增加,果膠酶的分配系數(shù)K也在增加。改變成相物質(zhì)在雙水相體系中的總濃度,實際上是改變了操作的加料點。從雙水相的相圖可知,體系中成相物質(zhì)的總濃度增加時,體系將遠(yuǎn)離臨界點,同時系線長度增加,兩相性質(zhì)的差別增大。在成相的三種物質(zhì):(NH4)2SO4、PEG1000和H2O中,PEG1000是極性最小的一種,其濃度增加,萃取相的極性減小,果膠酶是具有部分極性的非極性物質(zhì),因而其溶解度增加,所以果膠酶的分配系數(shù)增加。PEG1000濃度增加的同時也增加了相比,所以,增加PEG相的PEG1000濃度對分配系數(shù)和產(chǎn)量的提高都是有利的。但PEG1000濃度太高,使萃取相的極性降低太多,使具有強(qiáng)極性的(NH4)2SO4的溶解度降低甚至不溶,破壞了雙水相的形成條件,不能成相,萃取過程受到影響,在本實驗中,選擇PEG1000的濃度為27%,在此條件下,體系有較高的分配系數(shù)。2.3so4對果膠酶分配的影響在PEG1000濃度不變的情況下,改變PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中(NH4)2SO4的濃度,分別測定果膠酶在不同的雙水相體系中的分配系數(shù),實驗結(jié)果如表2所示。由以上數(shù)據(jù)可知,在PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)中,控制PEG1000的百分含量為27%,(NH4)2SO4的百分含量為19%時,果膠酶的分配系數(shù)K可以達(dá)到最大值,K=11.42。2.4ph對果膠酶分配系數(shù)的影響固定PEG1000的百分含量為27%,(NH4)2SO4的百分含量為19%,考察不同pH對果膠酶分配系數(shù)的影響,實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,果膠酶的分配系數(shù)K值隨pH值的增加先是增加達(dá)到最大值后逐漸下降,當(dāng)pH增加到5.0時,果膠酶在PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)中有最大的分配系數(shù)K=11.40。結(jié)果與果膠酶在pH5.0附近活力較強(qiáng)是一致的。2.5最適條件的確定固定PEG1000的百分含量為27%,(NH4)2SO4的百分含量為19%,pH為5.0,考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl對果膠酶分配系數(shù)的影響,實驗結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明:隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大,分配系數(shù)K先增大而后減小,在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%時K有最大值14.0。通常果膠酶的活性范圍在pH3.0~9.0之間,等電點在pH4.0~9.0之間,在最適pH4.0~6.5之間的酶為水解酶。商品果膠酶是各種酶構(gòu)成的混合物,pH5.0條件下,不同的果膠酶成分可帶有正或負(fù)電荷(等電點PI>5.0的果膠酶帶負(fù)電荷,PI<5.0的果膠酶帶正電荷),NaCl粒子可能在兩相中有不同的分配系數(shù),因而,隨著鹽濃度的增加,兩相間的電位差發(fā)生變化,因而使果膠酶的分配系數(shù)增加,但鹽濃度增加到一定程度后,萃取相的極性增強(qiáng),使果膠酶的溶解度下降而發(fā)生鹽析作用,分配系數(shù)明顯降低。2.6溫度對萃取分離的影響固定PEG1000的百分含量為27%,(NH4)2SO4的百分含量為19%,考察不同溫度對果膠酶分配系數(shù)的影響,實驗結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,溫度對果膠酶的分配系數(shù)K有一定的影響,溫度小于50℃時,隨著溫度的升高,果膠酶分配系數(shù)K逐漸增加,這是由于溶液溫度上升后,分子運動加強(qiáng),削弱了靜電排斥作用的影響,導(dǎo)致果膠酶分配系數(shù)增加。當(dāng)溫度大于50℃之后,分配系數(shù)K隨溫度的升高而逐漸減小,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于高溫引起部分酶失活,使果膠酶的分配系數(shù)K減小。對于PEG1000的百分含量為27%,(NH4)2SO4的百分含量為19%的PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng),溫度為50℃時,分配系數(shù)K=12.65,最有利于萃取分離。結(jié)果與果膠酶在40~50℃時有較高活性相一致。3peg/nh42so4的雙水相系統(tǒng)為3.1在PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)中,對所選定的成相物質(zhì)PEG,其分子量在1000時測得的酶活性最大,說明PEG1000對果膠酶活性的影響最小。故選取PEG1000為雙水相系統(tǒng)成相物質(zhì)。3.2通過對濃度PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)進(jìn)行考