電化學(xué)適體傳感器用于黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)的研究

電化學(xué)適體傳感器用于黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)的研究 目錄摘要 電化學(xué)分析法應(yīng)用于黃曲霉毒素檢測(cè)的進(jìn)展研究摘要：黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物，是黃曲霉和寄生曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有劇毒性和嚴(yán)重的致癌性、致畸性和致突變性。攝入被黃曲霉毒素污染的農(nóng)作物和食品會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重危害，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)黃曲霉毒素具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)電化學(xué)分析方法用于黃曲霉毒素的研究表明，構(gòu)建電化學(xué)傳感器檢測(cè)黃曲霉的方法相比于傳統(tǒng)的黃曲霉毒素檢測(cè)方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、成本低、便于微型化等諸多優(yōu)勢(shì)，有望在快速、在線、高靈敏準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的黃曲霉毒素方法上獲得突破。關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素，電化學(xué)，免疫傳感器，適體傳感器TheapplicationofelectrochemicalanalyticalmethodsindetectionofaflatoxinAbstract:Aflatoxinsareaseriesofcompoundswithsimilarchemicalstructure.Aflatoxinsexistwidelyinnature,whichissecondarymetaboliteofAspergillusflavusandAspergillusparasiticus,withhighlytoxicandseriouscarcinogenic,teratogenicandmutagenic.Wheningestedcropsandfoodcontaminatedaflatoxin,itisseriousharmtohumanandanimalhealth.Therefore,therapidandaccuratedetectionofaflatoxinhasimportantpracticalsignificance.Nearlyresearchreportshowsthatelectrochemicalanalyticalmethodshavebeenwidelyutilizedtodetectaflatoxinforitshighefficiency,highsensitivity,simpleoperation,lowcost,easyminiaturization.Itispredictablethattheobviouslybreakthroughinthisresearchfieldcouldbeexpectedinthefuture.Keywords:aflatoxin,electrochemicalimmunosensor,aptasensor黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相似的真菌次生代謝物，具有強(qiáng)毒性、高穩(wěn)定性、致畸性、致癌性、并且能抑制機(jī)體的免疫過(guò)程。在已發(fā)現(xiàn)的400多種黃曲霉毒素中，常見(jiàn)的黃曲霉毒素主要有B1.B2.M1.M2.G1.G2等幾種亞型，其中AFB1是最危險(xiǎn)的致癌物（毒性相當(dāng)于砒霜的68倍）[1]。黃曲霉毒素廣泛存在于糧食作物中，特別是對(duì)高溫高濕地區(qū)的玉米、花生、大米、堅(jiān)果的污染尤其嚴(yán)重。1993年，世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFB1確定為I類致癌物[2]。建立快速檢測(cè)食品中的黃曲霉毒素含量的方法對(duì)于食品安全和保障人民健康具有重要意義。目前，黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC）、膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、熒光光度法、高效液相色譜法（HPLC）等[3-11]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使用電化學(xué)分析法檢測(cè)黃曲霉毒素越來(lái)越受關(guān)注。電化學(xué)分析方法具有檢測(cè)快速、成本低、不受樣品顏色與濁度的影響、儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、體積小、快速、靈敏、選擇性高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在黃曲霉毒素檢測(cè)快速方法的發(fā)展中具有非常重要的意義。1、電化學(xué)免疫傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器是利用抗原抗體的特異性親和作用，通過(guò)檢測(cè)特異性識(shí)別作用前后的電流、電位、電阻等電信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子檢測(cè)。近年來(lái)的主要研究熱點(diǎn)集中在抗原抗體的固定和電信號(hào)放大技術(shù)的研究上[12-17]。黃曲霉毒素（AF）作為半抗原，通常需要和牛血清蛋白（BSA）結(jié)合形成BSA-AF復(fù)合物才能與相應(yīng)的抗體有效結(jié)合。電化學(xué)免疫傳感器是通過(guò)anti-AF對(duì)BSA-AF的特異性識(shí)別作用實(shí)現(xiàn)對(duì)AF的檢測(cè)。在生物分子固載方面，Owino等[18]用聚苯胺和聚苯乙烯磺酸修飾的鉑電極固定AFB1抗體,用牛血清白蛋白（BSA）封閉，識(shí)別AFB1后的免疫復(fù)合物可阻礙電子傳輸，阻抗分析表明，該傳感器的檢測(cè)限為0.1mg/L。Raquel等[19]利用G蛋白定向固載作用，將G蛋白和IgG功能化的碳納米管用于檢測(cè)污染大米中的黃曲霉，檢測(cè)限為10μg/g。王瑞鑫等[20]用殼聚糖一金溶膠復(fù)合膜修飾玻碳電極，AFB1抗體通過(guò)靜電作用吸附在電極表面制備出一種電化學(xué)免疫傳感器用于AFB1的檢測(cè)，具有更低的檢測(cè)限，其檢測(cè)限為0.05ng/g，線性范圍為0.1-1.1ng/g。為了增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度，研究者將將納米材料和新型導(dǎo)電材料等應(yīng)用到黃曲霉毒素免疫傳感器的構(gòu)建中，增大電極比表面積，增強(qiáng)電極表面的導(dǎo)電性能，提高檢測(cè)的靈敏度。碳納米材料因碳納米管和石墨烯的發(fā)展而廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究。Chandan等[21]將anti-AFB1抗體固載到羧基化多壁碳納米管上，并進(jìn)一步修飾到銦錫氧化物（ITO）玻片上，采用電化學(xué)循環(huán)伏安法檢測(cè)AFB1。周琳婷等[22]首先將氧化石墨烯、2，5二(2-噻吩)卜對(duì)苯甲酸吡咯和氯金酸依次電沉積到金電極表面形成導(dǎo)電高分子膜，再將AFB1抗體與之共價(jià)結(jié)合，采用循環(huán)伏安法和交流阻抗法檢測(cè)AFB1結(jié)果顯示，該導(dǎo)電高分子膜可有效增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度，檢出限為11×10-15mol/L，線性范圍2×10-15-3．2×10-13mol/L。隨著各種導(dǎo)電性能良好的新材料（如離子液體、導(dǎo)電聚合膜等）的出現(xiàn)，給電化學(xué)傳感器敏感界面的構(gòu)建提供了新思路。Li等[23]制備出一種硅膠-離子液體生物相容性膜固定anti-AFB1抗體，通過(guò)阻抗分析，與不含離子液的比對(duì)電極相比，結(jié)果表明離子液體能夠增大玻碳電極表面的導(dǎo)電性，減小電子轉(zhuǎn)移阻抗。同時(shí)，納米技術(shù)的更新使功能化的納米材料的協(xié)同效應(yīng)備受關(guān)注，Zhou等[24]將納米技術(shù)結(jié)合離子液體的優(yōu)良性能用于黃曲霉毒素的檢測(cè)(圖1)。首先在電極上固定一層石墨烯/導(dǎo)電聚合物/金納米粒子/離子液體復(fù)合膜，然后將anti-AFB1抗體共價(jià)固定在膜上。石墨烯和金納米粒子可加快電子轉(zhuǎn)移，且離子液體能為抗體提供優(yōu)良的微環(huán)境，使該傳感器呈現(xiàn)出靈敏度較高的特點(diǎn)，顯示出優(yōu)良的響應(yīng)性能。圖1基于石墨烯/導(dǎo)電聚合物/金納米粒子/離子液體復(fù)合膜的黃曲霉毒素電化學(xué)傳感器示意圖Fig.1.ProcedureforfabricationofthesensorbasedonGN/DPB/Au/ILmembrane.【24】為進(jìn)一步放大響應(yīng)信號(hào)，酶催化技術(shù)、納米技術(shù)和生物放大技術(shù)常被聯(lián)合用于黃曲霉毒素電化學(xué)免疫傳感器中[25-30]有研究者提出加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(ALP)等用于標(biāo)記抗體或抗原。Ammida等[31]在絲網(wǎng)印刷電極表面固定BSA-AFB1，與待測(cè)液中的游離AFB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合anti-AFB1抗體，ALP標(biāo)記二抗放大響應(yīng)信號(hào)，通過(guò)ALP催化底液中1-萘基磷酸鹽產(chǎn)生的增強(qiáng)的電流電流，用差分脈沖伏安法檢測(cè)電流改變以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。Tan等[32]構(gòu)建電流型免疫傳感器，利用酶催化銀沉淀的信號(hào)放大方法檢測(cè)大米中的AFB1，游離的AFB1與固定在巰基乙胺修飾的金電極表面的BSA-AFB1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合固定數(shù)量的anti-AFB1抗體，二抗標(biāo)記物堿性磷酸酶（ALP）催化底液中的抗壞血酸2-磷酸酯生成抗壞血酸，銀離子被還原成金屬銀沉積在電極表面，通過(guò)電流信號(hào)的改變檢測(cè)AFB1。Paniel等[33]將磁性納米顆粒結(jié)合酶標(biāo)記技術(shù)用于AFM1的檢測(cè)中，將anti-AFM1抗體包被在磁性納米顆粒表面，通過(guò)外加磁場(chǎng)將anti-AFM1抗體固定在絲網(wǎng)印刷電極表面，用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）作為競(jìng)爭(zhēng)性免疫標(biāo)記物，用計(jì)時(shí)電流法和循環(huán)伏安法檢測(cè)電流信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，檢測(cè)限為0.01ppb，線性范圍為0.01-0.1ppb。Tang等[34]也利用磁CoFe2O4納米粒子為核和普魯士藍(lán)納米粒子摻雜的二氧化硅為殼制備一種多功能磁性微珠（MMB），該磁性微珠用于固定AFB1–BSA，HRP標(biāo)記的anti-AFB1抗體和金納米顆粒結(jié)合，免疫反應(yīng)后在外加磁場(chǎng)的作用下，納米生物復(fù)合物附著在銦錫氧化物（ITO）電極表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)該體系電信號(hào)的檢測(cè)，檢測(cè)限為6.0pg/mL，線性范圍為0.05–12ng/mL。磁性納米材料具有修飾靈活性強(qiáng)、易收集、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在黃曲霉毒素的快速檢測(cè)方法的構(gòu)建中具有廣泛的應(yīng)用前景。2電化學(xué)適體傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的應(yīng)用電化學(xué)適體傳感器是以核酸為分子識(shí)別元件，根據(jù)適體與配體結(jié)合前后電化學(xué)信號(hào)的改變而建立的一種分析方法。核酸適體作為一種新型的分子識(shí)別原件，相比抗體有高親和性、高特異性、無(wú)免疫原性、靶分子種類多、易于合成與修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于生物傳感、臨床診斷等領(lǐng)域[35-38]。目前，電化學(xué)適體傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法研究也逐漸成為熱點(diǎn)[39-43]。Dinqkaya等[39]制備出一種基于DNA探針的阻抗型適體傳感器。該傳感器用硫醇修飾的單鏈DNA(SS-HSDNA)探針，通過(guò)與金納米顆粒共價(jià)交聯(lián)而固定在金電極上，AFM1分子能夠被ss-HSDNA特異性識(shí)別，從而增大電子轉(zhuǎn)移阻抗，通過(guò)識(shí)別前后的電阻變化實(shí)現(xiàn)對(duì)AFM1的檢測(cè)。NguyenBH等[40]制備一種適體傳感器檢測(cè)AFM1（圖2）。將Fe3O4/PANI固定在鉑微電極表面，APT探針固定在電極表面識(shí)別AFM1，磁性納米粒子作為信號(hào)放大元件，通過(guò)循環(huán)方波伏安法檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)變化，線性范圍為6-60ng/L，檢出限為1.98ng/L。適體傳感器用于檢測(cè)黃曲霉毒素時(shí)，不要求BSA與待測(cè)物先結(jié)合，簡(jiǎn)化了操作步驟。同時(shí)適體的黃曲霉毒素見(jiàn)的親和力高，其檢測(cè)的靈敏度和特異性都有明顯優(yōu)勢(shì)。圖2基于磁性納米粒子的信號(hào)增強(qiáng)性適體傳感器用于黃曲霉毒素檢測(cè)示意圖Fig.2Principleoflabel-freedetectionofAFM1withmagneto-electrochemicalFe3O4/PANibasedaptasensor.[40]3其他的電化學(xué)方法在黃曲霉毒素檢測(cè)中的應(yīng)用目前，絕大多數(shù)電化學(xué)方法都是基于黃曲霉毒素和生物分子之間的親和作用力而實(shí)現(xiàn)分析的，然而有研究者發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素可以吸附在懸汞電極表面并進(jìn)行不可逆還原反應(yīng)，Hajian等[44]使用懸汞電極作為工作電極，吸附溶出伏安法測(cè)定AFB1和AFB2，采用伏安掃描，使AFB1和AFB2從陰極溶出，根據(jù)溶出電流峰測(cè)定其含量。此外，Rejeb[45]利用黃曲霉毒素抑制乙酰膽堿酯酶的活性的特點(diǎn)，將膽堿氧化酶交聯(lián)在用普魯士藍(lán)修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面。（圖3）乙酰膽堿酯酶（AChE）催化乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿，再由膽堿氧化酶（ChOx）氧化膽堿為H2O2，普魯士藍(lán)還原H2O2，以此來(lái)檢測(cè)黃曲霉毒素。這些方法是建立在黃曲霉毒素自身的生化性質(zhì)上實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的，為豐富黃曲霉毒素的檢測(cè)手段提供了新思路，但這類方法受待測(cè)物質(zhì)自身的生化性質(zhì)限制，較難推廣到其它分子的檢測(cè)中。圖3酶催化增強(qiáng)的黃曲霉毒素檢測(cè)方法示意圖Fig.3SchematicrepresentationofenzymelabeledsystemforAFB1determination[45]4展望黃曲霉毒素廣泛存在于土壤、動(dòng)植物中，很容易對(duì)花生、玉米、小麥、大豆等糧油產(chǎn)品造成污染，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害非常大的一類霉菌毒素。目前，隨著傳感技術(shù)、材料科學(xué)、生物技術(shù)等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建電化學(xué)傳感器檢測(cè)黃曲霉毒素也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。與其他較傳統(tǒng)的分析方法相比，電化學(xué)分析法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、設(shè)備便于微型化、易于實(shí)現(xiàn)移動(dòng)檢測(cè)等諸多優(yōu)勢(shì)。在黃曲霉毒素的檢測(cè)過(guò)程中，納米技術(shù)、生物放大技術(shù)、催化放大技術(shù)的使用對(duì)提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性有著重要意義。構(gòu)建更快速、更簡(jiǎn)便、更靈敏的電化學(xué)檢測(cè)方法以適應(yīng)實(shí)際衛(wèi)生檢測(cè)的需要，還有著極大的發(fā)展進(jìn)步空間。參考文獻(xiàn)馬海華，張?jiān)?，甄彤等．電化學(xué)生物傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2016，31(2);132-140．張藝兵，鮑蕾，褚慶華．農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)分析[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006:5-7.FallahAA.AflatoxinM-1contaminationindairyproductsmarketedinIranduringwinterandsummer[J].FoodControl,2010,21(11):1478-1481.ZhangD,LiP,YangY,etal.AhighselectiveimmunochromatographicassayforrapiddetectionofaflatoxinB-1[J].Talanta,201l，85(1):736—742.ZhengN,SunP,WangJQ,etal.OccurrenceofaflatoxinM1inUHTmilkandpasteurizedmilkinChinamarket[J].FoodControl,2013,29(1):198-201.HussainI,AnwarJ.AstudyoncontaminationofaflatoxinM-1inrawmilkinthePunjabprovinceofPakistan[J].FoodControl,2008,19(4):393-395.WangYT,LiuXB,XiaoCX,etal.HPLCdeterminationofaflatoxinM-1inliquidmilkandmilkpowderusingsolidphaseextractiononOASISHLB[J],FoodControl,2012,28(1):131-134.XiongJL,WangSP,MaMR,etal.SeasonalvariationofaflatoxinM-1inrawmilkfromtheYangtzeRiverDeltaregionofChina[J],FoodControl,2013,34(2):703-706.CamponeL，PiccinelliAL，CelanoR，eta1．Applicationofdispersiveliquid—liquidmicroextractionforthedeterminationofallatoxinsB1，B2，G1andG2incerealproducts[J]．JournalofChromatographyA，2011，1218(42)：48-54.KhanMR，AlothmanZA，GhfarAA，WabaidurSM．Analysisofaflatoxinsinnonalcoholicbeerusingliquid-liquidextractionandultraperformanceLC-MS/MS[J]．JournalofSeparationScience，2013，36(3)：572-577.ZaldivarJ,NielsenJ,OlssonL.Fuelethanolproductionfromlignocellulose:achallengeformetabolicengineeringandprocessintegration[J].ApplMicrobBiotech,2001,56:21-31.FaridahS,lbtisamET．DetectionofSalmonellatyphimuriumusinganElectrochemicallmmunosensor[J]．BiosensorsandBioelectmnics,2009,24(8)：2630—2636．BondL，JuanCV，DuatoP，eta1．OchzatuxinAnanostructuredelectrochemicalimmunosensorsbasedonpolyclonalantibodiesandgoldnanoparticlescoupledtotheantigen[J]．AnalyticelMethods,2010(2):335—341．KamalM,KadirA,IbtizamE,etal．Developmentofanelectrochemicalimmunosensorforfumonisinsdetectioninfoods[J]．Toxins．2010(2)：382-398．劉繼超,姜鐵民,陳歷俊,等.電化學(xué)免疫傳感器在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J],中國(guó)食品添加劑,2011,1,216-222.SharmaA，MatharuZ，SumanaG，eta1．Antibodyimmobilizedcysteaminefunctionalized-goldnanoparticlesforariatoxindetection[J]．ThinSolidFilms，2010(3)：1213-1218.BacherG，PalS，KanungoL，eta1．Alabel-freesilverwirebasedimpedimetricimmunosensorfordetectionofaflatoxinMlinmilk[J]．SensorsandActuatorsB：Chemical，2012，168(1):223-230.OwinoJH0，IgnaszakA，AhmedA，eta1．ModellingoftheimpedimetricresponsesofanaflatoxinBlimmunosensorpreparedonanelectrosyntheticpolyanilineplatform[J]．AnalyticalandBioanalyticalChemistry，2007，388(5)：1069-1074.RaquelA,VillamizarAlicia,MarotoF,XavierRius,etal.RapiddetectionofAspergillusflavusinriceusingbiofunctionalizedcarbonnanotubefieldeffecttransistors[J].AnalBioanalche,2011,399(1):119-126.王瑞鑫,李書國(guó),基于納米材料構(gòu)建免疫傳感器快速測(cè)定糧油食品中的黃曲霉毒素B1，中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2016，29(1)：62-66.SChandan,SSaurabh,Carboxylatedmultiwalledcarbonnanotubesbasedbiosensorforaflatoxindetection[J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2013,258-264.周琳婷,李在均,方銀軍.石墨烯/導(dǎo)電高分子/離子液體修飾的黃曲霉毒素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