草魚中膠原的分離純化及其性質(zhì)研究

草魚中膠原的分離純化及其性質(zhì)研究

0魚類膠原蛋白的活性近年來，食物安全問題已成為人們關(guān)注的問題，而食物過敏問題仍在人們身上。隨著物流業(yè)的日益繁榮和食品消費(fèi)的逐年增加，食物過敏已經(jīng)影響人們的生活。根據(jù)流行病學(xué)研究，美國每年約有2.5%的人患有食物過敏，5%8%的兒童和嬰兒病例發(fā)生在5%8%的兒童和嬰兒病例中。1999年國際食品法規(guī)委員會(huì)發(fā)布的8種常見的高過敏食品中，有2種。這肉口感細(xì)膩，營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛。然而，魚和蝦之間的過敏問題也很常見。由于水的過敏機(jī)制和復(fù)雜性，目前的研究表明小清蛋是魚類的主要過敏。2001年，hamada等人首次提出了新的魚類凝膠。之后，sakaguki等人提取了多種魚類凝膠，并與過敏患者的血清進(jìn)行了個(gè)性化反應(yīng)，以驗(yàn)證魚廉氏蛋白的過敏性。目前，魚廉氏沉積物的研究主要集中在其性質(zhì)和加工應(yīng)用上，對蛋白質(zhì)和水的過敏研究相對較少。在這項(xiàng)工作中，我們使用了以鯉魚為實(shí)驗(yàn)材料，分離氨基酸含量，分析了蛋白質(zhì)與小青蛋白之間的穩(wěn)定性，通過酶聯(lián)免疫吸收實(shí)驗(yàn)和杜射實(shí)驗(yàn)分析了鈣支架的ige結(jié)合活性，并確定了鯉魚凝膠的過敏性。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)用證據(jù)鮮活鯉魚購于集美農(nóng)貿(mào)市場,現(xiàn)殺,直接用于實(shí)驗(yàn)或置于-20℃保存?zhèn)溆?魚類過敏患者血清取自集美大學(xué)醫(yī)療中心和廈門市第二醫(yī)院,血清均放于-30℃冰箱中凍存.1.2試驗(yàn)方法和儀器恒溫水浴鍋(Memmert,德國);組織搗碎機(jī)(Kinematica,瑞士);高速冷凍離心機(jī)(Beckman,美國);96孔板酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國);凝膠成像儀(ViblerLourmat,法國);超純水系統(tǒng)(Millipore,美國).1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1粗膠原蛋白的提取膠原蛋白的分離純化參照Zhang等人的方法,并做適當(dāng)修改.將鮮活鯉魚宰殺取皮,將皮下肉、結(jié)締組織用刀剔除.將獲得的魚皮剪成約2mm×2mm的碎片,于0.1mol/LNaOH溶液中組織搗碎,4℃下攪拌浸提24h,其中每隔6h換液一次,10000r/min離心15min,去上清,將沉淀充分水洗,溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%正丁醇,充分勻漿,4℃攪拌,浸提24h.隨后將有機(jī)溶劑處理后的樣品進(jìn)行水洗,溶于0.5mol/LHAc溶液中,輕微攪拌,提取48h,4℃下11500r/min離心20min后所得到的上清液即為粗膠原蛋白.取粗膠原蛋白樣品,加入NaCl至其最終濃度為0.9mol/L,4℃下9000r/min離心20min,所得沉淀為純化的膠原蛋白.所得沉淀復(fù)溶于0.5mol/LHAc,0.1mol/LHAc為外液透析3d后凍干備用.1.3.2sds-頁面分析SDS分析參照Laemmli法.1.3.3sds-東南角SGF參照美國藥典方法配制,豬胃蛋白酶、鰱魚小清蛋白由本實(shí)驗(yàn)室純化獲得.模擬胃液每1L中含有2gNaCl,并用HCl調(diào)節(jié)pH值至1.2.體外模擬胃液消化中,總反應(yīng)體積為1mL,在2只試管中分別加入SGF溶液與目的蛋白.其中一只試管中加入7μL酶液,對照試管中加入與酶液等體積的模擬胃液,于37℃水浴鍋中振蕩后反應(yīng),分別反應(yīng)0、1、5、15、30、60、120min后取樣50μL,于預(yù)先含有20μL終止液的離心管中混勻終止反應(yīng),進(jìn)行SDS分析.1.3.4gf消化穩(wěn)定性主要進(jìn)行膠原蛋白與小清蛋白的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、消化穩(wěn)定性以及高溫高壓穩(wěn)定性的比較.熱穩(wěn)定性比較:將膠原蛋白與小清蛋白于0、20、30、40、50、70、100℃下處理30min;pH穩(wěn)定性:將膠原蛋白與小清蛋白置于pH值依次為2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、11.0的緩沖液中,室溫下靜置1h;消化穩(wěn)定性參照步驟1.3.3,將膠原蛋白與小清蛋白的質(zhì)量濃度均調(diào)整為0.5g/L,SGF消化0、1、5、15、30、60、120min;高溫高壓穩(wěn)定性:將膠原蛋白與小清蛋白置于高壓滅菌鍋中,于121℃、0.14MPa條件下處理20min.所有處理后的樣品進(jìn)行SDS分析.1.3.5t-hp反應(yīng)ELISA檢測膠原蛋白和小清蛋白的IgE結(jié)合活性參照劉光明等人的方法,并做適當(dāng)修改.將蛋白樣品(200ng,每孔100μL)包被于酶標(biāo)板,于4℃包被16h,隨后用TBST洗滌(200μL),加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶(200μL)于37℃封閉1.5h,TBST洗滌(5×200μL).隨后加入1∶5稀釋的魚類過敏患者血清(50μL),在37℃下孵育2.5h,TBST充分洗滌(5×200μL)后加入1∶2000稀釋的羊抗人IgE-HRP(100μL)于37℃孵育1.5h.TBST清洗后加入TMB(100μL)顯色液于37℃避光顯色20min,2mol/L硫酸溶液(50μL)終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測OD450值.1.3.6兩組患者血清中dab-hrp的殘留Dot-blot分析膠原蛋白的IgE結(jié)合活性參照奧斯伯的方法,并做適當(dāng)修改.剪2塊邊長約為5mm的硝酸纖維素膜(NC膜),將蛋白質(zhì)點(diǎn)在NC膜的中央位置.點(diǎn)樣結(jié)束后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶于37℃封閉1.5h,然后用TBST洗去殘留.以1∶5稀釋的魚類過敏患者血清為一抗于37℃孵育2h,TBST洗5次,每次5min,然后以1∶2000稀釋的羊抗人IgE-HRP為二抗于37℃孵育1h,TBST洗5次,每次5min,最后用DAB顯色至膜上出現(xiàn)比較清晰的雜交斑點(diǎn),拍照.2結(jié)果2.1咸魚膠原蛋白的純化經(jīng)過堿溶、有機(jī)溶劑處理、酸溶以及NaCl鹽析后得到了鯉魚魚皮膠原蛋白,其結(jié)果見圖1.由圖1可以看出,鯉魚的膠原蛋白已經(jīng)得到高度純化,鯉魚膠原蛋白由2條α鏈組成(α1與α2),其中α1鏈含量相對較高,分子質(zhì)量約為120ku,α2鏈含量相對較低,其分子質(zhì)量約為115ku.在α鏈的上方還有大量的β鏈,分子質(zhì)量約為250ku,以及少量的大分子γ鏈.2.2gly緩沖液對小清蛋白的降解圖2顯示了膠原蛋白與小清蛋白的熱穩(wěn)定性比較結(jié)果,從圖2中可以看出:當(dāng)溫度低于50℃時(shí),膠原蛋白與小清蛋白均不發(fā)生明顯變化;當(dāng)溫度上升至70℃時(shí),膠原蛋白開始出現(xiàn)了比較明顯的降解,其中大分子的β鏈開始降解,小分子α鏈也出現(xiàn)了少量的降解;當(dāng)溫度上升至100℃時(shí),膠原蛋白的3條鏈均已降解;而隨著溫度逐漸升高到100℃,小清蛋白均不發(fā)生降解,在溫度為100℃時(shí),微量的小清蛋白形成了多聚體.圖3顯示了膠原蛋白與小清蛋白的pH穩(wěn)定性比較結(jié)果,由圖3可以看出,只有在pH=2.0的緩沖液中,膠原蛋白與小清蛋白都發(fā)生了明顯的降解,其中小清蛋白的降解更加明顯.推測原因可能是pH=2.0的Gly-HCl緩沖液中Gly的存在影響了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性.隨著pH值的逐漸升高,即使pH值達(dá)到11.0,膠原蛋白與小清蛋白均沒有出現(xiàn)相應(yīng)的降解條帶,膠原蛋白的3條鏈都保持完好,小清蛋白也不發(fā)生降解,但是相比對照組,二者條帶變淡,可能是由于在堿性條件下蛋白質(zhì)的溶解度有所降低.膠原蛋白與小清蛋白的模擬胃液消化穩(wěn)定性對比如圖4所示.由于這2種蛋白質(zhì)分子質(zhì)量差異較大,圖4采用了質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%～20%濃度的線性梯度膠.從圖4中可以看出,在不加酶的對照組中,加熱120min后小清蛋白與膠原蛋白均不發(fā)生明顯變化.實(shí)驗(yàn)組中,在消化進(jìn)行到1min時(shí),小清蛋白已經(jīng)呈現(xiàn)比較明顯的降解,降解產(chǎn)物分子質(zhì)量較小,而膠原蛋白的α鏈、β鏈均保持完好,γ鏈出現(xiàn)了少量的降解;在5min時(shí),膠原蛋白的α鏈、β鏈仍然不發(fā)生降解;當(dāng)消化進(jìn)行至15min時(shí),小清蛋白幾乎已經(jīng)消化完全,此時(shí)膠原蛋白的β鏈才開始出現(xiàn)降解趨勢,隨后它的α1鏈、α2鏈才開始出現(xiàn)降解;當(dāng)消化進(jìn)行至120min時(shí),膠原的3條鏈都已經(jīng)被分解,降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量大約在30～120ku之間.可以看出,小清蛋白的模擬胃液消化穩(wěn)定性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如膠原蛋白的.膠原蛋白與小清蛋白在高溫高壓條件下的穩(wěn)定性比較結(jié)果見圖5,圖5采用了121℃、0.14MPa條件處理20min,并采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%～20%濃度的線性梯度膠.由圖5可見,高溫高壓處理后,膠原蛋白的3條鏈已經(jīng)完全分解,與單純加熱不同,高溫高壓處理的分解產(chǎn)物的分子質(zhì)量比較集中,大約在10～40ku.而小清蛋白同時(shí)呈現(xiàn)了2種相反的情況,一部分小清蛋白降解成了小分子片段,同時(shí)有一部分小清蛋白發(fā)生了聚合反應(yīng),形成的多聚體分子質(zhì)量大約在20～30ku.2.3小鼠血清中cot-blct檢測的ige特異性反應(yīng)圖6顯示了純化后的鯉魚膠原蛋白與過敏患者血清的ELISA結(jié)果,其中陰性對照為健康人血清.從圖6中可以看出,在8份對魚類過敏的病人血清中,有3份對鯉魚膠原產(chǎn)生了特異性IgE反應(yīng)(1,3,6),而6份血清對鰱魚小清蛋白發(fā)生了特異性IgE反應(yīng)(1,2,3,4,5,6).同時(shí)對膠原蛋白與小清蛋白發(fā)生特異性IgE反應(yīng)的血清有3份(1,3,6).以鯉魚膠原蛋白為抗原,經(jīng)過ELISA篩選后的過敏患者血清(6號)為一抗,通過Dot-blot對膠原蛋白的IgE特異性反應(yīng)驗(yàn)證如圖7所示,以健康人血清為一抗的的Dot-blot圖中沒有出現(xiàn)雜交斑點(diǎn)(圖7a),而過敏患者血清與鯉魚膠原蛋白產(chǎn)生了特異性雜交斑點(diǎn)(圖7b、圖7c).3分子質(zhì)量的測定2001年Hamada等人首次提出魚類膠原蛋白可能為一種新型過敏原,而此前,已經(jīng)有大量報(bào)道證實(shí)魚類的主要過敏原為小清蛋白.目前對于魚類膠原蛋白引起過敏的研究相對較少,對魚類膠原蛋白的研究主要集中在其基本性質(zhì)與工業(yè)加工方法上,而關(guān)于牛類明膠(主要成分為Ⅰ型膠原)過敏的研究報(bào)道卻早有出現(xiàn),并且已經(jīng)有學(xué)者證實(shí)了牛類膠原的α2亞基對其致敏性有主要的決定作用.本文通過酸溶法分離純化得到了鯉魚魚皮中的Ⅰ型膠原蛋白,通過SDS分析得到鯉魚魚皮膠原蛋白主要由α鏈(α1與α2)、β鏈以及γ鏈組成,其中α1與α2的分子質(zhì)量分別為120ku和115ku,β鏈的分子質(zhì)量約為250ku,這與之前報(bào)道的鰱魚、尖吻鱸等膠原蛋白組成基本相同.通常來說,食物過敏原都有著較高的穩(wěn)定性,小清蛋白、原肌球蛋白等均耐熱耐酸,在加工蒸煮過程中不容易發(fā)生降解.本文比較了鯉魚膠原蛋白與鰱魚小清蛋白的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、模擬胃液消化穩(wěn)定性以及高溫高壓穩(wěn)定性,結(jié)果表明:在熱穩(wěn)定性方面,膠原蛋白不如小清蛋白,當(dāng)在100℃加熱30min后,膠原蛋白的3條鏈已經(jīng)完全降解,而小清蛋白幾乎不發(fā)生降解;2種蛋白的pH值穩(wěn)定性相似,在pH=2.0的緩沖液中都發(fā)生了明顯降解,但在pH=3.0～11.0膠原蛋白與小清蛋白都不發(fā)生明顯變化.在SGF消化過程中,小清蛋白在5min時(shí)就發(fā)生了明顯降解,在15min時(shí)基本已經(jīng)降解完全,而膠原蛋白在30min時(shí)才由β鏈開始發(fā)生降解,120min后仍未消化完全.在高溫高壓處理后,膠原蛋白明顯降解,而小清蛋白同時(shí)呈現(xiàn)了降解與聚合2種情況.通過魚過敏患者血清的ELISA實(shí)驗(yàn)可以看出,8份對魚類過敏的病人血清中,3份血清與膠原蛋白和小清蛋白同時(shí)發(fā)生了特異性IgE結(jié)合