下丘神經(jīng)元調(diào)頻聲調(diào)制方向選擇性與前掩蔽效應(yīng)

下丘神經(jīng)元調(diào)頻聲調(diào)制方向選擇性與前掩蔽效應(yīng)

自然界中的大多數(shù)聲音信號都是復(fù)雜的聲音，隨著時(shí)間的推移而動(dòng)態(tài)變化，其中頻率（m）是已知的。FM聲普遍存在于人類的語言聲和動(dòng)物的通訊聲中，是聽境(auditoryscene)的重要組成部分，在聲信號的識(shí)別方面發(fā)揮重要作用。FM聲信號包含多個(gè)參數(shù)，如調(diào)制方向(modulationorsweepdirection)、調(diào)制率(modulationrate)以及調(diào)制范圍(modulationrange)等。聽覺電生理研究已證實(shí)，在多種動(dòng)物的不同聽覺中樞均存在對FM聲反應(yīng)的神經(jīng)元，但具有不同調(diào)制方向選擇性神經(jīng)元的比例有所不同。先前關(guān)于調(diào)制方向選擇性形成的神經(jīng)機(jī)制研究大多采用細(xì)胞外記錄的方法，研究結(jié)果提示神經(jīng)元興奮性頻率調(diào)諧曲線(excitatoryfrequencytuningcurve,EFTC)兩側(cè)抑制區(qū)的不對稱性是調(diào)制方向選擇性形成的可能機(jī)制。Fuzessery等的研究還顯示抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的輸入導(dǎo)致神經(jīng)元對FM聲調(diào)制方向產(chǎn)生選擇性。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究也證實(shí)EFTC兩邊存在提前或推遲的低頻和高頻抑制。此外，當(dāng)記錄神經(jīng)元的抑制性輸入被阻斷后，神經(jīng)元對FM聲方向選擇性將減弱或消失，進(jìn)一步證實(shí)抑制性輸入在神經(jīng)元對FM聲方向選擇性中的重要作用。然而，這些推測仍缺乏更為直接的證據(jù)。前掩蔽(forwardmasking)是聽覺最為常見的掩蔽現(xiàn)象之一。早期研究結(jié)果顯示，前掩蔽效應(yīng)對聲源定位、聲頻率分析以及聲強(qiáng)編碼等聽覺功能活動(dòng)有著重要影響。本實(shí)驗(yàn)室先前采用在體細(xì)胞外記錄獲得的研究結(jié)果顯示，弱噪聲前掩蔽能夠銳化下丘(inferiorcolliculus,IC)神經(jīng)元的頻率調(diào)諧，并提高神經(jīng)元的反應(yīng)閾值；隨著掩蔽聲時(shí)程的增加，可減弱神經(jīng)元對探測聲的反應(yīng)，同時(shí)使神經(jīng)元的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)范圍變窄；掩蔽效應(yīng)的強(qiáng)弱還與雙聲的相對強(qiáng)弱、頻率和時(shí)間間隔等有關(guān)，前掩蔽的強(qiáng)度隨掩蔽聲強(qiáng)度的降低而減弱，隨著探測聲強(qiáng)度的減小和雙聲間隔時(shí)間的縮短而增強(qiáng)；當(dāng)采用偏離最佳頻率(off-bestfrequency,off-BF)的聲刺激作為掩蔽聲時(shí)，其掩蔽效應(yīng)弱于最佳頻率(bestfrequency,BF)聲刺激，但對大多數(shù)神經(jīng)元而言，低于BF的聲刺激的掩蔽效應(yīng)要比高于BF的聲刺激的掩蔽效應(yīng)強(qiáng)；為了探討其前掩蔽的機(jī)制，采用電泳導(dǎo)入不同類型的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑的方法，研究結(jié)果顯示前掩蔽與其神經(jīng)抑制有關(guān)。此外，近年來還有研究顯示，突觸前的一些機(jī)制也參與前掩蔽的形成。然而這些研究中采用的掩蔽聲多為純音，而FM聲的前掩蔽效應(yīng)則未見有報(bào)道，到目前對此仍缺乏認(rèn)識(shí)。由上述可見，神經(jīng)抑制參與了聽中樞神經(jīng)元的調(diào)制方向選擇性和前掩蔽的形成，那么FM聲的調(diào)制方向選擇性與神經(jīng)元的前掩蔽特性是否存在相關(guān)性？若存在，這種相關(guān)性與神經(jīng)元的頻率調(diào)諧特性有何關(guān)系？本實(shí)驗(yàn)以昆明小鼠(MusmusculusKm)聽覺中腦——IC為模型，研究了神經(jīng)元的FM聲調(diào)制方向選擇性及其與前掩蔽之間的關(guān)系和可能的神經(jīng)機(jī)制。1材料和方法1.1小鼠骨髓細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)共用了20只健康的雄性昆明小鼠[購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(鄂)2008-0005]，體重20～30g。動(dòng)物手術(shù)前，先用質(zhì)量百分比為0.48%戊巴比妥鈉(nembutal,0.02mL/g)腹腔注射麻醉，然后剪去頭頂被毛，切開頭皮，暴露顱骨，用蒸餾水擦去顱骨表面組織，并用95%的酒精使顱骨表面脫脂。用LOTITE406強(qiáng)力膠水將一根長約2.0cm的平頭釘固定于頭頂顱骨上，并用牙科水泥加固，供實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)固定動(dòng)物頭部。在IC所在位置對應(yīng)的顱骨上鉆一200～500μm的小孔，挑破硬腦膜，供實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)插入玻璃微電極。實(shí)驗(yàn)記錄期間，用頭皮注射針在動(dòng)物背部皮下給予質(zhì)量百分比為0.48%戊巴比妥鈉維持動(dòng)物的淺麻醉狀態(tài)。該研究得到華中師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核與批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前，將單管厚壁(外徑1.00mm，內(nèi)徑0.58mm)有芯玻璃微管(64-0787,HAR,USA)在微電極拉制器(PULL-100,WPI,USA)上拉制成尖端直徑小于1μm的微電極，電極內(nèi)充灌1mol/L的檸檬酸鉀(K3C6H5O7)溶液，阻抗30～160M?。1.2fm信號類雙聲刺激fmd的檢測方法實(shí)驗(yàn)采用自由聲場刺激，揚(yáng)聲器固定于俯仰方位0°的平面(該平面與動(dòng)物眼鼻線保持同一水平)、經(jīng)向方位對側(cè)60°(正對動(dòng)物外耳道口)。聲刺激信號由TDT系統(tǒng)(Tucker-DavisTechnologysystem3,Alachua,USA)給出，通過計(jì)算機(jī)控制TDT系統(tǒng)的給聲頻率、強(qiáng)度和時(shí)程等。聲刺激系統(tǒng)用聲級計(jì)(2610,B&K,Denmark)和1/4英寸麥克風(fēng)(4936,B&K,Denmark)校正。研究神經(jīng)元的FM聲調(diào)制或掃頻方向選擇性所用聲刺激信號為上掃(FMup-sweep,FMU)和下掃FM(FMdown-sweep,FMD)，F(xiàn)MU與FMD的聲強(qiáng)、時(shí)程、起落時(shí)間和掃頻范圍分別固定為80dBSPL、40ms、5ms和1～48kHz。然后，以神經(jīng)元的BF聲為信號聲或探測聲，不同掃頻方向的FM聲為掩蔽聲，制備成雙聲刺激模式，其刺激間隔(interval,Int)從40ms開始，按5ms或10ms的步長增加。將制備好的動(dòng)物放置于無回聲屏蔽室內(nèi)的防震臺(tái)上，動(dòng)物頭部的平頭釘固定在自制的支架上，并把單管玻璃微電極尖端正對IC上方顱骨的小孔，用電動(dòng)微電極推進(jìn)器(MO-81,Narishige,Japan)將電極垂直推入IC神經(jīng)元內(nèi)；先用純音(聲強(qiáng)80dBSPL、時(shí)程40ms，起落時(shí)間5ms)尋找聲敏感神經(jīng)元，記錄神經(jīng)元的深度(depth)和對不同頻率(1～48kHz)純音的反應(yīng)，即頻率調(diào)諧，并從中確定BF。再分別記錄神經(jīng)元對FMU和FMD的反應(yīng)。然后采用雙聲刺激，測定不同雙聲間隔下，F(xiàn)MU和FMD對BF聲的前掩蔽效應(yīng)。將神經(jīng)元對聲刺激的反應(yīng)傳到細(xì)胞內(nèi)放大器(DUO-773DualMicroprobeSystem3,WPI,USA)，然后并聯(lián)輸出至示波器(PM3084,WPI,USA)顯示和生物電信號采集分析系統(tǒng)(AxonDigidata1322A)數(shù)字化處理，最后存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，供實(shí)驗(yàn)結(jié)束后做進(jìn)一步處理與分析。1.3運(yùn)動(dòng)著精確度mi將神經(jīng)元對5次聲刺激反應(yīng)的動(dòng)作電位(actionpotential,AP)進(jìn)行疊加，計(jì)算出掃頻方向選擇性指數(shù)(directionalselectivityindex,DSI)，據(jù)此確定神經(jīng)元調(diào)制方向選擇性。DSI的計(jì)算公式為DSI=(U-D)/(U+D)，式中U和D分別代表神經(jīng)元在固定強(qiáng)度和調(diào)制范圍下對5次相同F(xiàn)MU和FMD刺激反應(yīng)的AP總數(shù)。若DSI>0.33，則為上掃選擇性或偏好(FMUselectiveorpreferneuron)——FMU神經(jīng)元；若DSI<-0.33，則為下掃選擇性或偏好——FMD神經(jīng)元；若-0.33<DSI<0.33，則神經(jīng)元無掃頻方向選擇性，簡稱FMN神經(jīng)元。為了比較不同調(diào)制方向FM聲的前掩蔽，我們引入神經(jīng)元的掩蔽指數(shù)(maskingindex,MI)。MI的計(jì)算公式為：MI=(n2-n1)/n2×100%，式中n1為神經(jīng)元在雙聲刺激下對探測聲(BF聲)的發(fā)放數(shù)，n2為神經(jīng)元在單獨(dú)BF聲刺激下的發(fā)放數(shù)。全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用one-wayANOVA和t檢驗(yàn)，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。作圖采用SigmaPlot10.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用mean±SD表示。2f的范圍實(shí)驗(yàn)共記錄到93個(gè)IC神經(jīng)元，全部神經(jīng)元的記錄深度和BF的范圍分別為433～1838(1121.0±361.8)μm和2～46(17.2±9.7)kHz；并對其中37個(gè)產(chǎn)生AP發(fā)放且數(shù)據(jù)完整的神經(jīng)元做了分析和討論。2.1fmd神經(jīng)元/kqp神經(jīng)元/kqp型神經(jīng)元的表征根據(jù)神經(jīng)元對不同調(diào)制方向FM聲的反應(yīng)，計(jì)算其DSI值，進(jìn)而確定神經(jīng)元的調(diào)制或掃頻方向選擇性類型。結(jié)果顯示54.1%(20/37)的神經(jīng)元對FM聲的調(diào)制方向具有選擇性，其中FMU神經(jīng)元的比例為32.5%(12/37)，F(xiàn)MD神經(jīng)元的比例為21.6%(8/37)，其余的神經(jīng)元(45.9%,17/37)表現(xiàn)為FMN(圖1A)。比較3種類型神經(jīng)元的BF，結(jié)果顯示FMU神經(jīng)元的BF[2～18kHz,(11.7±5.6)kHz]一般較低，F(xiàn)MD神經(jīng)元的BF[20～46kHz,(32.5±8.9)kHz]一般較高，而FMN神經(jīng)元的BF[9～35kHz,(16.2±6.9)kHz]則分布在中間頻帶(圖1B)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，3組神經(jīng)元平均BF之間存在顯著差異(圖1C,one-wayANOVA,P<0.001)。2.2fmd神經(jīng)元/神經(jīng)元自適應(yīng)的選擇測定神經(jīng)元對固定強(qiáng)度和時(shí)程的不同頻率純音刺激的反應(yīng)(圖2,3,4A)，即神經(jīng)元的頻率調(diào)諧。然后，將聲刺激改為FMU(圖2,3,4B)或FMD(圖2,3,4C)，測定神經(jīng)元對不同調(diào)制方向的FM聲的反應(yīng)，進(jìn)而確定神經(jīng)元的調(diào)制方向選擇性。最后，采用雙聲刺激，掩蔽聲為FMU(圖2,3,4D)或FMD(圖2,3,4E)，探測聲為BF純音，測定神經(jīng)元的前掩蔽。圖2所示為一個(gè)代表性的FMU神經(jīng)元，該神經(jīng)元對2kHz的純音刺激沒有任何反應(yīng)，隨著聲刺激頻率的增加(4～16kHz)，神經(jīng)元的反應(yīng)表現(xiàn)為AP；當(dāng)聲刺激的頻率為18kHz時(shí)，神經(jīng)元發(fā)放數(shù)最多且潛伏期最短，即此時(shí)聲刺激頻率為神經(jīng)元的BF；隨著聲刺激頻率的繼續(xù)增加(20～25kHz)，神經(jīng)元AP的發(fā)放數(shù)逐漸降低；當(dāng)聲刺激的頻率大于31kHz后，神經(jīng)元的反應(yīng)表現(xiàn)為抑制性突觸后電位(inhibitorypostsynapticpotential,IPSP)，即在神經(jīng)元頻率調(diào)諧曲線的高頻側(cè)存在一個(gè)抑制區(qū)(圖2A)。在FMU和FMD聲的刺激下，該神經(jīng)元的發(fā)放數(shù)分別為3個(gè)和1個(gè)(圖2B,C)，通過5次重復(fù)刺激的AP發(fā)放數(shù)(圖2F)，計(jì)算DSI值為0.56，即該神經(jīng)元表現(xiàn)為FMU選擇性。在雙聲刺激模式下，當(dāng)掩蔽聲為FMU時(shí)，雙聲間Int較短時(shí)神經(jīng)元對探測聲的反應(yīng)受到掩蔽聲的影響，但隨著Int的增加MI逐漸降低，當(dāng)Int達(dá)到200ms時(shí)MI降到0(圖2Da～f)；當(dāng)掩蔽聲為FMD時(shí)，神經(jīng)元對探測聲的反應(yīng)也受到掩蔽聲的影響(圖2Ea～f)，在Int為120ms時(shí)MI降到0(圖2De)。比較該神經(jīng)元MI達(dá)到50%時(shí)的Int，結(jié)果顯示，當(dāng)掩蔽聲為FMU時(shí)，50%MI對應(yīng)的Int為60ms，而掩蔽聲為FMD時(shí)為40ms。計(jì)算FMU神經(jīng)元(n=12)MI達(dá)到50%時(shí)的平均Int，可見在FMU掩蔽聲刺激下MI達(dá)到50%時(shí)的平均Int為(60.0±15.0)ms；而在FMD掩蔽聲刺激下MI達(dá)到50%時(shí)的平均Int為(40.4±1.4)ms，二者間有顯著差異性(pairedt-test,P<0.001，圖2H)。圖3所示為一個(gè)代表性的FMD神經(jīng)元，對低頻聲刺激的反應(yīng)表現(xiàn)為IPSP，即存在一個(gè)低頻的抑制區(qū)，而隨著聲刺激頻率的增加，神經(jīng)元的反應(yīng)表現(xiàn)為AP的發(fā)放，該代表性神經(jīng)元的BF為24kHz(圖3A)。在FMU和FMD刺激下，該神經(jīng)元的反應(yīng)都表現(xiàn)為AP，但發(fā)放數(shù)不同(圖3B,C)，計(jì)算5次重復(fù)刺激下的AP發(fā)放數(shù)(圖3F)，得出神經(jīng)元的DSI為-0.38，即該神經(jīng)元為FMD神經(jīng)元。雙聲刺激模式下，神經(jīng)元對探測聲的反應(yīng)受到掩蔽聲的影響，隨著Int的增加影響逐漸降低(圖3Da～d，圖3Ea～d)。當(dāng)Int≥200ms時(shí)，F(xiàn)MU對探測聲的掩蔽效應(yīng)消失，MI降到0(圖3De,f)。而當(dāng)Int≥240ms時(shí)FMD對探測聲的掩蔽效應(yīng)消失(圖3Ee,f)。比較兩種掩蔽聲模式下神經(jīng)元MI達(dá)到50%的Int，可見掩蔽聲為FMU時(shí)，50%MI對應(yīng)的Int為60ms，而掩蔽聲為FMD時(shí)，50%MI對應(yīng)的Int為80ms(圖3G)。計(jì)算FMD神經(jīng)元(n=8)在不同掩蔽聲下MI達(dá)到50%的平均Int，當(dāng)掩蔽聲為FMU時(shí)，平均Int為(54.4±12.6)ms；當(dāng)掩蔽聲為FMD時(shí)，平均Int則為(70.6±23.2)ms，二者間具有顯著差異性(pairedt-test,P<0.05，圖3H)。在本實(shí)驗(yàn)中，還記錄到一些FMN神經(jīng)元(n=17)，這些神經(jīng)元對FM聲無調(diào)制方向選擇性。圖4為1個(gè)代表性的FMN神經(jīng)元，當(dāng)聲刺激的頻率較低時(shí)(2kHz)，該神經(jīng)元的反應(yīng)為興奮性突觸后電位(excitatorypostsynapticpotential,EPSP)，但當(dāng)刺激頻率增加到4kHz時(shí)神經(jīng)元的反應(yīng)表現(xiàn)為AP，且該反應(yīng)形式在聲刺激頻率達(dá)到FM掃頻范圍最大值時(shí)仍未發(fā)生改變，但反應(yīng)潛伏期略有變化，定義潛伏期最短時(shí)為神經(jīng)元的BF，即16kHz。實(shí)驗(yàn)中沒有在興奮區(qū)外觀察到抑制區(qū)的存在(圖4A)。該神經(jīng)元對FMU和FMD的反應(yīng)都為單個(gè)AP(圖4B,C)。該神經(jīng)元對FMU反應(yīng)的發(fā)放數(shù)與對FMD的反應(yīng)發(fā)放數(shù)相等(圖4F)，累加神經(jīng)元對5次重復(fù)刺激的AP發(fā)放數(shù)，計(jì)算得到的DSI為0，說明該神經(jīng)元無調(diào)制方向選擇性。在雙聲刺激模式下，當(dāng)Int在較小時(shí)(<50ms)，F(xiàn)MU和FMD掩蔽下的MI為100%(圖4Da,b;Ea,b)。隨著Int的增加，MI迅速達(dá)到0(圖4Dc～e;Ec～e)，F(xiàn)MU和FMD掩蔽下達(dá)到50%MI的Int皆為47.5ms(圖4G)，即二者的掩蔽效應(yīng)相同。計(jì)算FMN神經(jīng)元(n=17)MI達(dá)到50%的平均Int，可見在FMU和FMD掩蔽下達(dá)到50%MI的平均Int分別為(68.4±42.8)ms和(68.1±42.3)ms，二者間無顯著性差異(pairedt-test,P>0.05，圖4H)。3討論3.1fmu神經(jīng)元在fmd音頻調(diào)諧中的調(diào)諧作用本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞內(nèi)記錄方法，對所獲得的37個(gè)反應(yīng)為AP的神經(jīng)元做了分析，結(jié)果顯示20(54.1%)個(gè)神經(jīng)元表現(xiàn)出有調(diào)制方向選擇性或偏好，其中12(32.5%)個(gè)為FMU神經(jīng)元，8(21.6%)個(gè)為FMD神經(jīng)元，其余17(45.9%)個(gè)神經(jīng)元為FMN神經(jīng)元?？梢?，具有調(diào)制方向選擇性神經(jīng)元與不具有方向選擇性神經(jīng)元的比例相當(dāng)，這與之前采用細(xì)胞外記錄在家鼠以及蒼白蝠(pallidbat)IC上所獲得的結(jié)果類似。雖然具有調(diào)制方向選擇性神經(jīng)元的比例在不同物種中所占比例差異不大，但FMU和FMD神經(jīng)元所占的比例在不同物種中卻有較大差異。如蒼白蝠的聽皮層(auditorycortex,AC)和IC中所有的FM聲方向選擇性神經(jīng)元皆為FMD神經(jīng)元，而大鼠AC神經(jīng)元中具有FM聲方向選擇性的神經(jīng)元大多數(shù)為FMU選擇性，F(xiàn)MU和FMD神經(jīng)元的比例為75%和25%，再次說明神經(jīng)元的FM聲調(diào)制方向選擇性在不同哺乳動(dòng)物聽中樞具有普遍性，成為神經(jīng)元聽和識(shí)別聲信號的重要基礎(chǔ)及特性；其分布比例差異的原因很有可能與不同種類動(dòng)物的聽聲環(huán)境和聲通訊信號特點(diǎn)有關(guān)。先前關(guān)于調(diào)制方向選擇性形成的神經(jīng)機(jī)制研究大多采用細(xì)胞外記錄的方法，根據(jù)這些結(jié)果認(rèn)為其形成主要是由于在神經(jīng)元EFTC兩側(cè)存在不對稱性的抑制區(qū)所致；后來有人在研究中采用電泳導(dǎo)入抑制性遞質(zhì)受體拮抗劑的方法，觀察到GABA的輸入?yún)⑴c了神經(jīng)元FM聲調(diào)制方向選擇性的形成，去抑制后其調(diào)制方向選擇性減弱乃至消失。眾所周之，中樞神經(jīng)元接受眾多的突觸輸入，無不影響神經(jīng)元的興奮性，去除的抑制是否為特異性的？由于未能直接觀察到和獲得抑制性突觸輸入的證據(jù)致使長期以來備受爭議。本實(shí)驗(yàn)對此采用細(xì)胞內(nèi)記錄方法，從測定到的神經(jīng)元頻率調(diào)諧結(jié)果來看，F(xiàn)MU神經(jīng)元，由抑制性突觸輸入構(gòu)成的抑制區(qū)分布在興奮區(qū)高頻側(cè)(邊)(圖2A)，在FMU聲刺激時(shí)首先激活興奮區(qū)，再接著激活抑制區(qū)，此時(shí)抑制區(qū)的活動(dòng)對神經(jīng)元的興奮性反應(yīng)基本無影響；而FMD聲刺激則正好與FMU相反，首先被激活的是抑制區(qū)，產(chǎn)生的抑制性突觸輸入抑制了神經(jīng)元的興奮反應(yīng)，從而使得神經(jīng)元表現(xiàn)為FMU選擇性(圖2B,C,F)。FMD神經(jīng)元的頻率調(diào)諧特點(diǎn)正好與FMU神經(jīng)元相反(圖3A)，從而使得其表現(xiàn)為FMD選擇性(圖3B,C,F)。而對于FMN神經(jīng)元，盡管在其頻率調(diào)諧的興奮性反應(yīng)區(qū)兩側(cè)無明顯的抑制區(qū)存在(圖4A)，提示其頻率調(diào)諧范圍被定型很有可能是在IC下的聽覺核團(tuán)內(nèi)，并在其興奮區(qū)的兩側(cè)均帶有抑制區(qū)，使之對FMU和FMD聲刺激反應(yīng)基本相近，顯示出無調(diào)制方向選擇性(圖4B,C,F)。Voytenko和Galazyuk利用在體細(xì)胞內(nèi)記錄的方法，研究了小棕蝠IC神經(jīng)元對其回聲定位FM(80～20kHz)信號，以及對所制備成的3個(gè)FM(80～60,60～40和40～20kHz)亞成分的反應(yīng)，將3種亞成分反應(yīng)的結(jié)果總和后與80～20kHzFM反應(yīng)的結(jié)果相比，可見1/3的神經(jīng)元對80～20kHzFM反應(yīng)的結(jié)果與3種亞成分FM反應(yīng)線性時(shí)相總和后的結(jié)果相近，2/3的神經(jīng)元?jiǎng)t呈3種亞成分FM反應(yīng)的非線性的時(shí)相