利用反相色譜法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中基因組dna甲基化水平

利用反相色譜法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中基因組dna甲基化水平

廣泛的甲基甲基化在植物和動(dòng)物體內(nèi)被用作不同生理?xiàng)l件下的形態(tài)特征。常用的分析方法主要是配有紫外檢測(cè)的高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳(CE),HPLC結(jié)合電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)聯(lián)用技術(shù)也越來(lái)越常用,目前反相高效液相色譜技術(shù)被公認(rèn)為檢測(cè)核苷酸、堿基的理想方法。近年來(lái)的研究表明,DNA的甲基化水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此甲基化的程度與狀態(tài)為臨床腫瘤等疾病的診療提供了可信的科學(xué)數(shù)據(jù)。本研究利用反相高效液相色譜法對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7基因組DNA的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè),建立研究DNA甲基化的色譜技術(shù)平臺(tái),為進(jìn)一步的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1測(cè)器、溶劑過(guò)濾系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)品戴安公司Ultimate3000高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司,包括WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣閥、VWD-3400RS可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、FLM-3100柱溫箱、DGP-3600M壓力泵),溶劑過(guò)濾系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)、安瓿瓶(美國(guó)Agilent公司)。堿基標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司):脫氧胞嘧啶(dC)和甲基化脫氧胞嘧啶(5mdC);甲醇為色譜純(德國(guó)Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水;醋酸銨、核酸酶P1、DNA酶Ⅰ、RNA酶A購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;堿性磷酸酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司。1.2方法1.2.1rna酶a去除rna的酶a體外培養(yǎng)乳腺癌MCF7細(xì)胞的DNA采用QIAampDNABloodMiniKit提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取后,用終濃度為10μg/ml的RNA酶A去除含有的RNA;DNA水解過(guò)程參照已有文獻(xiàn)的方法:10μgDNA溶于10μTris-Cl(25mmol/L,pH8.0),10U的DNA酶Ⅰ在37℃處理1h,再100℃變性3min,迅速于冰上冷卻10min,加入1μl核酸酶P1后放入37℃水浴中16h,然后加入堿性磷酸酶1.5U處理2h,于-20℃保存。1.2.3質(zhì)量濃度配比根據(jù)人類基因組DNA甲基化水平約為5%,因此將購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品5mdC和dC按照質(zhì)量濃度比1∶20配制。其中5mdC質(zhì)量濃度系列為:1、2、4、8ng/μl,dC質(zhì)量濃度系列為:20、40、80、160ng/μl。利用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件,進(jìn)樣量為0.2μl。1.3dna甲基化水平數(shù)據(jù)處理軟件為ChromeleonVersion6.80(美國(guó)Dionex公司);采用外標(biāo)法定量,以W(5mdC)/[W(dC)+W(5mdC)]100%(單位為ng/ngDNA)的方式來(lái)表征DNA甲基化水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中dC和5mdC各自的含量,然后通過(guò)公式:(5mdC)%=W(5mdC)/[W(dC)+W(5mdC)]100%,得出MCF7細(xì)胞系DNA甲基化水平。2結(jié)果2.1色譜條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)用的兩個(gè)C18反相柱分別是戴安公司的Nano和Micro柱,即柱子的直徑為75μm和1.0mm,已經(jīng)測(cè)試合格,并具有較佳的柱效。對(duì)于流動(dòng)相的選擇,本研究用醋酸銨-甲醇、酸化甲醇-甲酸、醋酸銨-乙腈溶液等多種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明以醋酸銨-甲醇溶液得到的分離效果最好。將已稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品dC和5mdC為樣品進(jìn)行分離條件的優(yōu)化,當(dāng)線性梯度洗脫條件為:0~20min,0~30%甲醇,7.5%醋酸銨時(shí),dC與5mdC可以達(dá)到完全分離(圖1)?？梢钥闯?采用MicroLC體系的分離圖,峰寬較窄,分辨率較高,分離效果明顯優(yōu)于NanoLC體系,故以后實(shí)驗(yàn)采用MicroLC體系。2.2微膠囊的制備將5mdC和dC的母液按1∶20的質(zhì)量比混合,再逐級(jí)稀釋至濃度分別為1、2、4、8ng/μl和20、40、80、160ng/μl。實(shí)驗(yàn)采用MicroLC體系,使用的定量方法為外標(biāo)法。將各稀釋液分別進(jìn)樣0.2μl進(jìn)行檢測(cè),以濃度為橫坐標(biāo),積分面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),相關(guān)系數(shù)r分別為99.82%和99.89%。2.3確性和重復(fù)性研究實(shí)驗(yàn)采用人乳腺癌細(xì)胞MCF7基因組DNA水解產(chǎn)物作為質(zhì)量控制樣品,對(duì)本方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行了研究。取平行樣品在同一天內(nèi)不同時(shí)間以及同一樣品在不同天數(shù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)試,結(jié)果表明5mdC和dC測(cè)定值平行樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、樣品的日內(nèi)偏差和日間偏差(RSD)范圍在2%~5%(表1),表明本方法具有良好的重復(fù)性。2.4保留時(shí)間的確定利用上述分析方法對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞內(nèi)基因組DNA甲基化水平進(jìn)行檢測(cè),將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品MCF7的水解產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的兩個(gè)峰圖即dC與5mdC與樣品中的兩個(gè)峰匹配完好,可得到各自的保留時(shí)間:dC為5.747min,5mdC為7.753min(圖3);同時(shí),將該結(jié)果圖整理得到表2。最后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中的dC和5mdC的含量,進(jìn)而得出MCF7細(xì)胞系DNA甲基化水平為19.3%。3dna甲基化檢測(cè)近幾年,表觀遺傳學(xué)改變的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展,成為腫瘤臨床基礎(chǔ)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。表觀遺傳學(xué)是研究非DNA序列變化引起的基因表達(dá)的改變,是研究表達(dá)在時(shí)間和空間上的調(diào)控問(wèn)題,其中最主要的研究?jī)?nèi)容就是DNA甲基化。DNA甲基化修飾是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下,以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上,癌基因多為不充分甲基化,導(dǎo)致表達(dá)異常;抑癌基因多為過(guò)度甲基化,導(dǎo)致表達(dá)不足[8~10]。對(duì)腫瘤DNA甲基化的研究,應(yīng)根據(jù)目的選擇合適的方法,明確是研究整體水平的甲基化還是研究特定位點(diǎn)的甲基化。對(duì)DNA中CpG島的甲基化分析涉及多種分子生物學(xué)方法,如甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHSO3法(包括BSP測(cè)序法、甲基化特異性PCR、熒光定量法)、芯片技術(shù)等。對(duì)DNA整體甲基化水平的研究,主要靠的是高效液相色譜、質(zhì)譜等精密儀器。可見(jiàn),研究基因組DNA甲基化的方法多種多樣,一方面說(shuō)明甲基化研究難度大,另一方面也說(shuō)明這些方法都存在著局限性。本次研究通過(guò)采用反相色譜技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7中基因組DNA甲基化水平的檢測(cè),成功將DNA水解產(chǎn)物進(jìn)行分離、定量。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),DNA水解產(chǎn)物對(duì)于C18反相柱為弱保留化合物,流動(dòng)相選用甲醇-醋酸銨緩沖液較為合適;比較MicroLC和NanoLC的分離圖譜,雖然二者都足以達(dá)到分離效果,但前者可以得到較窄的峰寬圖,因此其分離效果要優(yōu)于NanoLC;對(duì)MCF7細(xì)胞系甲基化的總體水平定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),反相HPLC可以得到較佳的分析重現(xiàn)性,樣品定量結(jié)果表明,MCF7基因組甲基化水平高于正常細(xì)胞,推測(cè)該細(xì)胞系中的部分抑癌基因甲基化程度過(guò)度異常,導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)下降,使腫瘤發(fā)生?？傊?建立基于高效液相色譜(HPLC)技術(shù)的DNA甲基化研究平臺(tái),可以為今后進(jìn)一步研究某種基因甲基化的特定位點(diǎn)奠定基礎(chǔ),此外,深入研究DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系及作用機(jī)制為腫瘤的早期診斷與臨床治療提供了新的思路。1.2.2反相柱及色譜條件戴安Ultimate3000型HPLC系統(tǒng),色譜柱為戴安公司NanoLC(75μm×15cm,5μm粒徑)和MicroLC(1.0mm×15cm,5μm粒徑)的C18反相柱。流動(dòng)相:A,去離子水;B,50mmol/L醋酸銨(pH5.0)