齒突蟾屬4物種皮膚組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)研究

齒突蟾屬4物種皮膚組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)研究

皮膚作為兩棲動物和棲息地環(huán)境直接接觸的器官，在進化過程中形成了身體和環(huán)境之間的第一個天然屏障，具有防御、呼吸、舒適度、繁殖、調(diào)節(jié)和其他功能。皮膚腺體包括顆粒腺和粘液腺,能夠抵御病原微生物入侵、調(diào)節(jié)滲透壓、維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,兩棲類皮膚在維持機體生存、適應棲息地及復雜的生態(tài)環(huán)境中起著重要的作用(Toledo&Jared,1995;Zugetal.,2001)。對我國兩棲動物皮膚的組織學觀察已在部分有尾類(杜春華,1992;吳淑輝,呂九全,1994;陸宇燕,李丕鵬,1999;唐以杰等,1999;劉炯宇,2004;陸宇燕等,2004;陳貴英等,2005;徐劍,2007)和無尾類(耿欣蓮,1959;張賢芳等,2002;梁剛,王瓊霞,2004;劉滿櫻等,2007;林文達等,2008;林文達,朱靜,2009)中展開,這些研究顯現(xiàn)出皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)與機體生態(tài)適應功能緊密聯(lián)系,如以下2個方面:(1)水棲性強的物種,如大鯢Andriasdavidianus、山溪鯢Batrachuperuspinchonii等,皮膚光滑,表皮角化程度低,毛細血管豐富,皮膚在呼吸中占有重要地位;陸棲性較強的物種,如爪鯢Onychodactylusficsheri、中華蟾蜍Bufogargarizans等,皮膚表皮角化程度高,能有效防止水分的散失。(2)皮膚在不同的季節(jié)略有變化,這些變化與能量吸收、繁殖相關聯(lián),如東北林蛙Ranadybowskii、隆肛蛙Feiranaquadrana疏松層內(nèi)黑色素細胞在不同季節(jié)排列分布有改變,又如多疣狹口蛙Kaloulaverrucosa在繁殖期粘液腺會增多。齒突蟾屬Scutiger隸屬兩棲綱Amphibia無尾目Anura角蟾科Megophryidae,可分為2個亞屬:以陸棲為主的齒突蟾亞屬S.(Scutiger)Theobald,1868和以水棲為主的貓眼蟾亞屬S.(Aelurophryne)Boulenger,1919。本屬物種皮膚較粗糙,頭骨一般寬大于長,上頜無齒或有小齒突,或個別種齒較明顯(費梁等,2009)。齒突蟾屬物種主要分布于中國的西部高原,低溫、高海拔、強紫外輻射是其生境的重要特點,物種為適應這種極端環(huán)境,機體必然有相應的適應策略。皮膚作為機體與環(huán)境接觸的第一道屏障,在生態(tài)適應中可能起著重要的作用,是研究這種生態(tài)適應的理想材料。本文以西藏齒突蟾S.(S.)boulengeri、刺胸貓眼蟾S.(A.)mammatus、木里貓眼蟾S.(A.)muliensis和胸腺貓眼蟾S.(A.)glandulatus為代表,從組織學水平初步觀察了不同部位皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點,旨在豐富兩棲類的形態(tài)學內(nèi)容及比較組織學的基礎資料,并探討兩棲動物皮膚結(jié)構(gòu)與環(huán)境適應的關系。1材料和方法1.1動物材料實驗用西藏齒突蟾、刺胸貓眼蟾、木里貓眼蟾和胸腺貓眼蟾各3只,標本詳細信息見表1。1.2皮膚組織結(jié)構(gòu)觀察標本保存于10%福爾馬林,每個標本體背和體腹各取皮膚樣品約1cm×1cm,常規(guī)石蠟包埋切片法制作組織切片(王曉東,湯樂民,2007)。長期保存于10%福爾馬林中的已經(jīng)固定標本,皮膚取樣后流水沖洗48h,轉(zhuǎn)入70%酒精。逐級濃度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。切片厚度6~8μm,HE染色,中性樹膠封片。LeicaDMRA2顯微鏡觀察并攝像,目鏡測微尺結(jié)合軟件ImageJND2測量。每塊皮膚均勻取5個位點分別測量表皮層數(shù)、表皮厚度、疏松層厚度、致密層厚度及皮膚總厚度數(shù)據(jù)。記錄皮膚樣品切面上1cm長的皮膚所含粘液腺和顆粒腺的數(shù)量及其長短徑,具體方法為顯微鏡觀察計數(shù)粘液腺和顆粒腺,長短徑通過目鏡測微尺測量。皮膚切面為直線的,直接用目鏡測微尺測量其長度;若皮膚切面為彎曲狀,以相同放大倍數(shù)下臺鏡測微尺為標尺,結(jié)合軟件ImageJND2測量照片上的皮膚長度。一般皮膚切片長度約為1cm,統(tǒng)計每條皮膚切片具體的長度,按比例將本條切片中粘液腺和顆粒腺的數(shù)量折合成1cm長度下的數(shù)量。Excel2003數(shù)據(jù)錄入,SPSS17.0進行T檢驗,以0.05作為差異顯著性的判斷標準,所有數(shù)據(jù)都以均值±標準誤的形式表示,由于樣品有限,未考慮性別差異。2結(jié)果2.1從淋巴中分離齒突蟾屬皮膚與已報道兩棲動物皮膚結(jié)構(gòu)基本相同,分為表皮和真皮兩部分(封3,圖1)。皮膚腺體包括粘液腺和顆粒腺兩種,皮下有大的淋巴間隙,易與其下的組織剝離。在齒突蟾屬4個物種的體背、體腹皮膚真皮疏松層中,發(fā)現(xiàn)一種HE染色呈藍色條帶的特殊物質(zhì),如圖1紅色箭頭所指為鈣化層(laminacalcarea),是皮膚內(nèi)骨骼(integumentaryskeletion)的一種。2.1.1層細胞的發(fā)育表皮為復層上皮,含多層細胞,從外向內(nèi)分為角質(zhì)層、顆粒層、棘細胞層和生發(fā)層。角質(zhì)層由角化的扁平細胞組成,細胞角化均勻,并與顆粒層細胞區(qū)分明顯。西藏齒突蟾表皮角質(zhì)層有1~2層細胞,刺胸貓眼蟾、木里齒突蟾和胸腺貓眼蟾表皮角質(zhì)層只有1層細胞。顆粒層有1~2層細胞,腹部顆粒層較背部明顯,呈圓形、橢圓形或梭形,顆粒層向外推移,角化形成角質(zhì)層。棘細胞層有2~3層細胞,背部細胞核多為橢圓形或梭形,腹部多為圓形或橢圓形。棘細胞向外推移,細胞由大的多邊形逐漸變小,細胞核由長橢圓形漸變?yōu)樾E圓形,形成顆粒層。生發(fā)層位于表皮最內(nèi)層,有1層細胞。背部細胞呈橢圓形,核大,橢圓形;腹部生發(fā)層呈立方柱形,排列緊密整齊,核長橢圓形。生發(fā)層細胞為表皮干細胞,不斷產(chǎn)生新的細胞向外層推移,逐漸分化為各層細胞。2.1.2皮膚組織病理學觀察真皮層位于表皮下,較表皮厚,含有豐富的細胞類型和結(jié)構(gòu),分為內(nèi)外兩層,外層為疏松層或海綿層,內(nèi)層為致密層。疏松層緊貼在表皮生發(fā)層下面,分布有大量色素細胞、纖維、神經(jīng)、血管及腺體。皮膚毛細血管分布于表皮與真皮的相接處,并與表皮平行排列成一排。西藏齒突蟾皮膚毛細血管數(shù)量相對較少,木里貓眼蟾較多,刺胸貓眼蟾和胸腺貓眼蟾毛細血管分布最多,并凸入表皮。色素細胞HE染色條件下棕黑色,細胞形狀不規(guī)則,很多分支交織形成色素層,主要分布在疏松層最外層,也散布于致密層,此外4物種的體背表皮中也可見少量的黑色素細胞。齒突蟾屬4物種背部色素層都非常發(fā)達,腹部的色素層也較發(fā)達。真皮致密層由排列緊密的膠原纖維呈平行波浪狀交織而成,并有垂直排列的纖維束伸至表皮基底。在HE染色條件下,致密層呈淡粉色,整體顏色較疏松層要深。2.1.3皮質(zhì)he染色皮膚腺體有兩種,即粘液腺和顆粒腺,位于真皮疏松層。兩種腺體均為多細胞腺體,由分泌部和導管組成,多個腺上皮組成分泌部,并向下凹陷于真皮疏松層內(nèi),呈球狀結(jié)構(gòu);導管由柱狀上皮細胞組成,與表皮細胞相連,開口于體表。粘液腺個體較小,周身體表都有分布,上皮細胞呈立方形,分泌部中空,HE染色呈淡藍色。顆粒腺個體較大,上皮細胞間無明顯的界限,HE染色有紅色顆粒,主要分布于體背。皮下層位于真皮之下,主要由疏松結(jié)締組織、淋巴間隙及血管構(gòu)成。此層與真皮交界處有發(fā)達的淋巴間隙,使皮膚易與其下的組織分離。2.2突浚體表皮厚度差異齒突蟾屬背部和腹部表皮細胞層數(shù)、皮膚厚度均有差異(表2),4物種背部表皮層數(shù)比腹部少,胸腺貓眼蟾體腹表皮最厚。統(tǒng)計學分析表明,西藏齒突蟾的體背、體腹表皮厚度差異顯著(P<0.05),木里貓眼蟾與胸腺貓眼蟾體背、體腹表皮厚度差異極顯著(P<0.01)。西藏齒突蟾體背疏松層厚于致密層(P<0.05);貓眼蟾亞屬3物種中,同一物種的真皮疏松層體背比體腹厚(P<0.01),體背疏松層比致密層厚(P<0.01)。皮膚整體厚度,刺胸貓眼蟾與胸腺貓眼蟾體背厚于體腹(P<0.05);西藏齒突蟾與木里貓眼蟾體背厚度均值也大于體腹,但差異不顯著。2.3皮膚組織中的密度粘液腺的外形比顆粒腺小,數(shù)量則較顆粒腺多,周身體表都有分布,統(tǒng)計每塊皮膚1cm長切片內(nèi)所含粘液腺的數(shù)量及其長短徑(表3)。顆粒腺多分布于背部,僅在木里貓眼蟾和胸腺貓眼蟾的體腹各發(fā)現(xiàn)一個顆粒腺,且個體較小。每塊皮膚統(tǒng)計1cm長切片內(nèi)所含顆粒腺的數(shù)量及其長短徑(表4)。3討論3.1齒突浚屬植物的皮膚顯微觀察兩棲類屬于水陸間的過渡類型,為適應陸地生活防止體內(nèi)水分大量散失,表皮開始角質(zhì)化。西藏齒突蟾、刺胸貓眼蟾、木里貓眼蟾和胸腺貓眼蟾一般棲息于中小型山溪的石頭間隙內(nèi),或在河邊緩流處石下,所在環(huán)境一般植被稀少,大小卵石甚多。成體白天棲息在溪內(nèi)或溪邊的石頭下,夜間外出捕食。齒突蟾亞屬體型窄長,陸棲性較貓眼蟾亞屬強,貓眼蟾亞屬體型肥碩,一般不遠離水源活動,行動遲緩(費梁等,2009)。比較齒突蟾屬2亞屬4個物種的皮膚顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),西藏齒突蟾表皮角質(zhì)化程度稍高于其它3個物種,表皮角質(zhì)層有1~2層細胞,其它3個貓眼蟾亞屬物種只有1層。這可能與齒突蟾亞屬物種陸棲性較貓眼蟾亞屬強有關,陸棲性強則更需防止水分的散失,表皮層角質(zhì)化程度稍高是其皮膚結(jié)構(gòu)對生活環(huán)境的適應。但與皮膚表皮角化可達3層(耿欣蓮,1959)的陸棲性更強的蟾蜍類相比,齒突蟾亞屬的陸棲性也只是稍強,因此其生活環(huán)境只能局限在水體附近。一般認為表皮角化程度低,毛細血管豐富是水棲性較強的物種皮膚結(jié)構(gòu)的重要特征,這說明皮膚在呼吸中占有重要地位,這些特征在大鯢(吳翠蘅,高武,1983)、商城肥鯢(吳淑輝,呂九全,1994)、爪鯢(陸宇燕等,2004)以及隆肛蛙(梁剛,王瓊霞,2004)的皮膚顯微觀察中均有報道。本研究發(fā)現(xiàn)毛細血管在齒突蟾屬皮膚淺表層的排列分布,尤其在貓眼蟾亞屬較明顯,毛細血管數(shù)量多且凸入表皮,說明了該類群物種皮膚呼吸的重要性。皮膚厚度數(shù)據(jù)表明,齒突蟾屬物種體腹表皮層數(shù)比體背多,厚度也比體背厚,這與其營陸棲生活爬行運動中腹面皮膚的抗磨損保護有關。皮膚整體厚度在4個物種中都是體背厚于體腹,這與已報道的東北林蛙和中華蟾蜍軀干背側(cè)皮膚厚于腹側(cè)相吻合(張賢芳等,2002;劉滿櫻等,2007)。體背疏松層里含有較多的顆粒腺與粘液腺,結(jié)締組織在體背分布更發(fā)達,發(fā)達的結(jié)締組織交織成網(wǎng),增強了背側(cè)皮膚的彈性和韌力,更加能適應環(huán)境。3.2皮膚屏障的作用齒突蟾屬物種主要分布于中國的西部高原,低溫、高海拔、強輻射是其生活環(huán)境的顯著特點。皮膚組織學觀察發(fā)現(xiàn),齒突蟾屬物種體背的色素層非常發(fā)達,體腹也有較發(fā)達的色素層。一般認為,兩棲動物皮膚中分布的色素細胞,在光線和溫度的影響下,可通過擴展、聚攏的形態(tài)變化,引起體色改變,形成保護色或警戒色(Hunsaker&Johnson,1959)。色素層發(fā)達,皮膚顏色加深,有助于齒突蟾屬物種從外界環(huán)境吸收較多熱量,滿足自身新陳代謝的需要。黑色素細胞與抵抗紫外輻射的關系,在人的皮膚上研究得較多,黑色素細胞能有效減少紫外線對機體的傷害(Kaidbeyetal.,1979)。針對兩棲動物全球性衰退的現(xiàn)象,不少學者在研究紫外輻射與兩棲動物的衰退的關系時,發(fā)現(xiàn)紫外輻射會導致兩棲動物的胚胎畸形,降低幼體的成活率,同時也發(fā)現(xiàn)高海拔分布的兩棲動物(如歐洲林蛙Ranatemporaria),幼體或成體皮膚里的色素細胞,包括黑色素細胞,能有效防止紫外輻射的傷害(Hofer&Mokri,2000;Blaustein&Belden,2003)。由此推測,高海拔地區(qū)生活的齒突蟾屬物種,皮膚內(nèi)發(fā)達的色素層,尤其是在體腹的廣泛分布,正是對其生活環(huán)境中強紫外輻射的適應。3.3皮膚內(nèi)骨骼和皮膚教育的研究本實驗在齒突蟾屬4個物種的體背、體腹真皮疏松層里發(fā)現(xiàn)的特殊物質(zhì),HE染色呈藍色條帶,看不出細胞結(jié)構(gòu),位于色素層的下方,初步認為是鈣化層(laminacalcarea)。皮膚鈣化層屬于皮膚內(nèi)骨骼,其發(fā)育機制至今還沒有很好的解釋,有假說認為是由成纖維細胞礦化形成,沒有細胞結(jié)構(gòu),為非膠原機質(zhì),含有多糖蛋白(包括糖聚胺糖)以及羥基磷灰石狀晶體(Vickaryous&Sire,2009)。Vickaryous和Sire(2009)總結(jié)了四足類皮膚中的皮膚內(nèi)骨骼(integumentaryskeletion),無尾兩棲類中皮膚內(nèi)骨骼包括皮膚骨化(osteoderm)和皮膚鈣化層(laminacalcarea)兩種。在雙色葉泡蛙Phyllomedusabicolor有皮膚骨化的報道(Vickaryous&Sire,2009),在海蟾蜍Bufomarinus(Tol