3-np對運動大鼠紋狀體的保護(hù)作用

3-np對運動大鼠紋狀體的保護(hù)作用

事實上，條紋體包括身體的學(xué)習(xí)記憶、感覺感知、運動和協(xié)調(diào)機(jī)。此外，hd（hunterondisease）不獨立舞蹈樣的運動、神經(jīng)精神障礙和認(rèn)知功能的降低明顯與線條體的機(jī)械作用有關(guān)。臨床和實驗表明，hd的病理變化明顯伴有著條紋體。興奮毒性損害機(jī)制牽涉人類HD的發(fā)生和發(fā)展過程,喹啉酸(quinolinicacid,QA)為其實驗研究的典型動物模型;其為谷氨酸類似物和NMDA受體激動劑,通過促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸的釋放和干擾谷氨酸的重吸收選擇性地作用紋狀體神經(jīng)元。而另一假說是HD時神經(jīng)元線粒體代謝機(jī)能障礙牽涉到琥珀酸脫氫酶,此能量代謝損害激發(fā)NMDA受體過度激活,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載和神經(jīng)元死亡。因此,琥珀酸脫氫酶抑制劑3-硝基丙酸(3-nitropropionicacid,3-NP)作為HD能量代謝障礙機(jī)制方面的實驗研究模型。綜觀目前HD的實驗研究,在形態(tài)學(xué)方面仍有許多尚待證實的問題,包括紋狀體損害的定位、神經(jīng)元損傷的類型和性質(zhì)的確切鑒定。為此,本研究以3-NP作為實驗動物模型探測證實3-NP誘導(dǎo)實驗大鼠的運動行為學(xué)變化,組織學(xué)證實3NP導(dǎo)致紋狀體損害的部位,以及紋狀體不同類型神經(jīng)元對3NP損害的敏感特異性,為全面認(rèn)識HD的病理機(jī)制提供形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1動物分組、給藥和輸注正常雄性成年SD大鼠20只,體質(zhì)量250～300g(中山大學(xué)實驗動物中心提供)。3-NP(Sigma,12.5mg/mL,生理鹽水配制)腹腔注射(20mg·kg-1·d-1),2次/d,連續(xù)給藥5d。大鼠完成給藥12h后處死。用于組化和免疫組化染色的動物,用25%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.7mL/kg體重),經(jīng)過心臟快速灌注0.9%生理鹽水400mL,繼用4%多聚甲醛(0.1mol/LPB配制,pH7.4)400mL灌注固定。常規(guī)取腦后浸于20%蔗糖(含4%多聚甲醛)中,4℃,直至沉底。半導(dǎo)體冰凍系列切片(厚40μm),備用于各種組織學(xué)染色。1.2前嘴唇停留時間的測定于3-NP處理前5d至注射后5d(共計10d),實驗大鼠分別進(jìn)行握力測試和平衡木測試。握力測試:在厚的泡沫墊上空50cm處懸掛一根長35cm、粗2mm的鋼絲,記錄大鼠前爪在上面懸掛的時間。一天測試兩次,共10d。平衡木測試:讓大鼠從平衡木(長120cm,寬7cm,離地面35cm處)的一端走到另一端的食物箱內(nèi)(24.5cm×20.0cm×18.0cm),每天測試3次,共10d。記錄大鼠前進(jìn)之前的停留時間(啟動延擱時間,包括大鼠被放到平衡木起點到開始前進(jìn)20cm的時間間隔),通過全程的時間(從大鼠被放到平衡木起點到鼻子剛好進(jìn)入暗箱的時間間隔),以及前爪滑落的次數(shù)(即footslips,前爪低于平衡木表面以下1.5cm的次數(shù))。如果大鼠落下或時間超過3min即為未完成。1.3免疫組化1.3.1sl組化染色取5只動物腦塊按照常規(guī)步驟進(jìn)行切片HE和Nissl組化染色。Tunel染色嚴(yán)格按照InSituCellDeathDetectionKit,POD(Roche)試劑說明書步驟進(jìn)行。1.3.2切片處理與形片制備取5只動物,用0.9%生理鹽水灌注,快速取腦,置于新鮮配制的Golgi-cox溶液中,室溫,避光浸泡14d。轉(zhuǎn)入30%蔗糖,室溫,避光浸泡3～5d。振動切片,收集于70%酒精中,裱片,晾干。DW洗1min,28%氨水1∶1(in雙蒸水)避光30min,雙蒸水洗1min,避光放置30min,梯度酒精脫水,透明,封片。1.3.3恒冷切片、烘干取5只動物,用冷PBS(含10%甘油)灌注,快速取腦,恒冷切片。裱片,晾干。用0.3%mmol/LNBT,0.05molPB和0.05M/L琥珀酸鈉混合液染色,37℃,30min。室溫晾干,脫水,透明,封片。1.3.4小鼠和兔darpp32表達(dá)對藥敏試驗取5只動物腦切片。步驟如下:(1)0.1mol/LPB(pH7.4)洗3次;(2)0.3%雙氧水(0.1mol/LPB,pH7.4),室溫,30min;(3)小鼠單克隆抗NeuN抗體(1∶500,Chemicon公司),兔多克隆抗Darpp32抗體(1∶250,CellSignaling公司),4℃,36h;(4)相應(yīng)的抗小鼠或抗兔IgG(1∶100,Sigma公司),室溫,3h;(5)相應(yīng)的小鼠或兔PAP(1∶200,Sigma公司),室溫,2h;(6)DAB-H2O2顯色2～8min。各步驟之間用0.1mol/LPB(pH7.4)洗3次,每次5min。在完成顯色之后進(jìn)行裱片,常規(guī)脫水、透明、封片。1.4統(tǒng)計處理對所獲實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行均數(shù)比較的單向方差分析(one-wayANOVA),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.13-np誘導(dǎo)前后大鼠前3-np前3-n前3-n前3-np前3-np前3-np前3評分的比較紋狀體牽涉到機(jī)體運動和運動協(xié)調(diào)機(jī)能。因此,本實驗設(shè)計對3-NP模型大鼠進(jìn)行運動行為學(xué)檢測和評價。平衡木測試結(jié)果顯示,實驗大鼠的啟動延擱時間和完成全過程時間均比3-NP誘導(dǎo)之前明顯延長(P<0.05,P<0.05,圖1C),同時顯示3-NP處理的大鼠前爪滑落次數(shù)與3-NP處理之前相比較也具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,圖1A′、1D)。握力實驗測試結(jié)果顯示,3-NP處理大鼠的抓握時間也比3-NP處理之前明顯延長(P<0.05,圖1B、E)。2.23golgis染色組織學(xué)(Nissl和HE染色)探察顯示3-NP誘導(dǎo)紋狀體的損傷區(qū)恒定出現(xiàn)于紋狀體的背外側(cè)區(qū),其出現(xiàn)率為80%(12/15),在損傷區(qū)(見圖2A,B,星號示)和周邊區(qū)神經(jīng)元發(fā)生嚴(yán)重丟失,在周邊區(qū)可見一些體積較大染色較深的神經(jīng)元幸存(圖2A′和B′,黑色箭頭示)和炎癥細(xì)胞浸潤(白色箭頭示)。經(jīng)典Golgi組化染色顯示紋狀體損傷區(qū)也在紋狀體背外側(cè)區(qū)明顯可見(圖2C,星號示),在周邊區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少,受累神經(jīng)元的樹突出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化(圖2C′);可見樹突呈現(xiàn)銳角彎曲(白色箭頭示)和斷裂(黑色箭頭示)。琥珀酸脫氫酶SDH(succinatedehydrogenase)組化染色在紋狀體背外側(cè)區(qū)同樣出現(xiàn)一塊明顯的淡染區(qū)(圖2D,星號示),在其周圍和遠(yuǎn)離區(qū)可見一些深染色的細(xì)胞(圖2D′,箭頭示)。2.3經(jīng)元數(shù)量的變化業(yè)已證實,NeuN為神經(jīng)元特異性抗體。借助此抗體染色顯示3-NP導(dǎo)致紋狀體背外側(cè)呈現(xiàn)一塊恒定的損傷區(qū)(圖3A★),在其周圍可見一個淡染色環(huán),在紋狀體損傷區(qū)域神經(jīng)元絕大部分均已丟失,損傷周邊區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量也顯著減少(圖3A′)。同時借助Darpp-32免疫組化染色(此被證實為紋狀體投射神經(jīng)元的特異性抗體)顯示3-NP組的紋狀體背外側(cè)區(qū)(圖3B,★)同樣出現(xiàn)一塊恒定的病灶區(qū),該區(qū)域少見幸存的神經(jīng)元,在損傷周邊區(qū)神經(jīng)元的丟失(圖3B′)比NeuN陽性神經(jīng)元更嚴(yán)重(圖3A′),而且幸存的多為體積較大的神經(jīng)元。Tunel組化為神經(jīng)元凋亡的特異性染色,結(jié)果顯示正常紋狀體少見Tunel陽性細(xì)胞,但在3-NP組紋狀體的損傷區(qū)(圖3C,★)及其周邊區(qū)均可見大量Tunel陽性細(xì)胞,高倍鏡觀察顯示(圖3C′)這些陽性細(xì)胞明顯呈現(xiàn)大(見圖3C′白色箭頭所示)、小(黑色箭頭所示)兩種形態(tài)。3討論3.1hd動物模型的篩選HD是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退變性疾病,臨床表現(xiàn)為不自主的舞蹈樣運動、神經(jīng)精神障礙和認(rèn)知機(jī)能低下等特征,其病理學(xué)特征主要是紋狀體嚴(yán)重萎縮和神經(jīng)元大量丟失。盡管Htt(Huntingtin)基因現(xiàn)在已被鑒定并證實為HD的始動因素,興奮毒性、代謝障礙和氧化應(yīng)激仍然被認(rèn)為是導(dǎo)致HD紋狀體神經(jīng)元死亡的重要原因。目前常用的HD動物模型有紋狀體注射QA和腹腔注3-NP模型;前者所使用的QA為谷氨酸類似物和NMDA受體激動劑,通過促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸的釋放和干擾谷氨酸的重吸收選擇性地作用于紋狀體神經(jīng)元。3-NP是琥珀酸脫氫酶的不可逆抑制劑,通過阻斷三羧酸循環(huán)或線粒體電子傳輸鏈上的復(fù)合物-2產(chǎn)生毒性作用。3-NP模型與臨床HD在病理變化和行為表現(xiàn)方面極為相似,由于3-NP能產(chǎn)生相對選擇性的紋狀體神經(jīng)元死亡,從而完美地模擬人類HD的病理學(xué)和行為學(xué)特征。本實驗為此采用3-NP大鼠模型,目前的平衡木和握力運動行為學(xué)測試結(jié)果再一次證實3-NP注射明顯導(dǎo)致實驗大鼠的肌肉強(qiáng)直和運動協(xié)調(diào)障礙。具有重要意義的是本實驗從組織病理學(xué)方面的探測顯示,3-NP誘導(dǎo)大鼠紋狀體的損傷恒定出現(xiàn)于紋狀體的背外側(cè)區(qū),而且主要病理變化為大量神經(jīng)元的丟失,結(jié)合實驗動物運動行為學(xué)嚴(yán)重障礙,這些結(jié)果明顯提示3-NP對紋狀體的損害具有選擇特異性,更為重要的是可以借助此結(jié)果反證紋狀體背外側(cè)區(qū)域的運動調(diào)節(jié)機(jī)能。因此,本實驗?zāi)壳暗馁Y料對于后續(xù)深入研究紋狀體生理機(jī)能和HD病理機(jī)制具有重要價值。3.2紋狀體映射神經(jīng)元形態(tài)學(xué)研究證實,紋狀體是基底核的主要成分,與隨意運動的穩(wěn)定、肌張力的維持以及肢體姿勢的調(diào)節(jié)活動相關(guān)。紋狀體如此碩大的實質(zhì)性團(tuán)塊,主要由大量的神經(jīng)元所構(gòu)成。因此,紋狀體的細(xì)胞構(gòu)筑極其復(fù)雜,其神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)方面主要分為投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元兩大類型。前者包括紋狀體-黑質(zhì)(直接通路)和紋狀體-蒼白球(間接通路)神經(jīng)元。后者包括膽堿能神經(jīng)元,GABA/Parvalbumin神經(jīng)元和Somatostasin/NOS神經(jīng)元等。有研究顯示,HD疾病主要損傷紋狀體的投射神經(jīng)元,而中間神經(jīng)元則相對幸免。因此,本文目前的免疫組織化學(xué)實驗中所借用的兩種神經(jīng)元特異性標(biāo)記物,一種特異性地標(biāo)記全部神經(jīng)元(包括中間神經(jīng)元和投射神經(jīng)元);另一種僅僅特異性地標(biāo)記紋狀體投射神經(jīng)元。雖然兩種免疫組化結(jié)果均顯示3-NP誘導(dǎo)紋狀體神經(jīng)元的嚴(yán)重丟失,但結(jié)果明顯證實紋狀體投射神經(jīng)元的丟失更為嚴(yán)重。為進(jìn)一步證實3-NP的作用機(jī)理和紋狀體神經(jīng)元的損傷性質(zhì),本實驗結(jié)合SDH染色結(jié)果顯示,在3-NP所誘導(dǎo)的紋狀體損害區(qū)受累神經(jīng)元SDH的活性明顯降低,而在損傷周邊及其遠(yuǎn)離區(qū)出現(xiàn)一些較大體積神經(jīng)元的SDH強(qiáng)烈反應(yīng),這些神經(jīng)元在