高活性乳酸脫氫酶啤酒酵母菌株的選育

高活性乳酸脫氫酶啤酒酵母菌株的選育

啤酒風(fēng)味是影響啤酒質(zhì)量的重要因素之一。高酒精是啤酒的重要味道之一。適宜的高級(jí)醇含量及各種高級(jí)醇之間的比例可使酒體豐滿(mǎn)圓潤(rùn),口感柔和協(xié)調(diào);但高級(jí)醇含量過(guò)高時(shí),不僅會(huì)給啤酒帶來(lái)異雜味,還會(huì)使消費(fèi)者飲后頭痛、頭暈、發(fā)墜。生產(chǎn)中常采取低溫發(fā)酵、增加接種量、嚴(yán)格控制供氧等多種措施,使優(yōu)質(zhì)啤酒中高級(jí)醇含量控制在50～90mg·L-1。但是低溫發(fā)酵會(huì)使雙乙酰的還原減慢,發(fā)酵周期延長(zhǎng);增加接種量使酵母制備周期延長(zhǎng),限制設(shè)備生產(chǎn)能力;嚴(yán)格控氧則大大增加設(shè)備及運(yùn)營(yíng)成本,這些問(wèn)題特別在夏天旺季生產(chǎn)中更加突出。降低啤酒中高級(jí)醇含量的首選措施是改良啤酒酵母的特性,然而有關(guān)低含量高級(jí)醇酵母菌種選育方面的研究?jī)H有一些思路,尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究以酵母高級(jí)醇相關(guān)代謝途徑為理論基礎(chǔ),建立了一套通過(guò)誘變及乳酸平板、麥芽汁-碳酸鈣平板、TTC上層平板顯色法篩選分離低含量高級(jí)醇啤酒酵母的方法,旨在獲得低產(chǎn)率高級(jí)醇的啤酒酵母菌株。1材料和方法1.1病毒啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YZD,由揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品科學(xué)系保藏。1.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基(MM):青島啤酒(揚(yáng)州)有限公司提供麥芽汁,稀釋至8～10°P,pH自然。酵母完全培養(yǎng)基(CM,g·L-1):蛋白胨20,酵母膏10,葡萄糖20,pH6.0。乳酸培養(yǎng)基(LM,g·L-1):乳酸40,硫酸銨5,磷酸二氫鉀1,氯化鈉0.1,硫酸鎂0.5,氯化鈣0.1,酵母膏0.2,pH6.0。上述培養(yǎng)基加瓊脂20g·L-1成為固體培養(yǎng)基,0.1MPa滅菌20min。麥芽汁-碳酸鈣培養(yǎng)基(MCM):在MM固體培養(yǎng)基中加入干熱滅菌后的碳酸鈣1.5g·L-1。TTC上層培養(yǎng)基(TTC,g·L-1):TTC0.5,乳酸5,瓊脂15,pH6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(FM):12°P麥芽汁(α-AN為161～180mg·L-1),pH自然,0.09MPa滅菌20min。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1in-1振蕩發(fā)揮將啤酒酵母接種于MM斜面,25℃培養(yǎng)36～48h使其活化,接一環(huán)于20mLMM中,20℃、120r·min-1振蕩過(guò)夜;取0.1mL接入另一20mLMM中,20℃、120r·min-1振蕩培養(yǎng)至600nm處吸光值(A600)約為0.7(以空白培養(yǎng)基作參照)時(shí),4000r·min-1離心10min收集酵母菌體,用適量無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,再懸浮于10mL無(wú)菌生理鹽水中,10倍系列逐級(jí)稀釋并計(jì)數(shù),取濃度約為106mL-1備用。1.3.2菌株的篩選和復(fù)篩取10mL酵母菌懸液于90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中,用15W紫外燈進(jìn)行誘變處理,照射距離25cm。采用不同的照射處理時(shí)間,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算酵母致死率。初篩:將誘變處理過(guò)的酵母細(xì)胞均勻涂布在LM上,置黑暗處25℃培養(yǎng)3～5d。挑選生長(zhǎng)菌落較大、菌層較厚的菌株約40～50株轉(zhuǎn)接于MCM上于25℃培養(yǎng)3d,菌落影印到LM上,25℃培養(yǎng)3d。菌落長(zhǎng)成后加入TTC暗培養(yǎng)2～3h,挑選出在MCM上生長(zhǎng)較好、中央隆起較突出、溶鈣圈較適中、乳酸培養(yǎng)基上紅色較深的菌株。復(fù)篩:用FM200mL在10～12℃培養(yǎng)5～6d后復(fù)篩初選菌株。以原始出發(fā)株為對(duì)照,分別測(cè)定高級(jí)醇和乳酸含量,選擇高級(jí)醇含量低、乳酸含量高的菌株。1.3.3發(fā)酵及貯藏期間d復(fù)篩所得菌株在500mLFM中10～12℃主發(fā)酵6d,8℃后發(fā)酵及低溫貯藏18～25d,測(cè)定高級(jí)醇和雙乙酰含量,同時(shí)檢測(cè)外觀濃度、α-氨基氮、乳酸等指標(biāo),以出發(fā)菌株做平行對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)法。1.4發(fā)酵工藝分析高級(jí)醇、雙乙酰含量采用蒸餾分光光度法測(cè)定;外觀濃度、酒精度、外觀發(fā)酵度、實(shí)際發(fā)酵度等采用啤酒分析常規(guī)方法測(cè)定;乳酸含量采用改良的對(duì)羥基聯(lián)苯法測(cè)定;乳酸脫氫酶活性采用紫外分光光度法測(cè)定。2結(jié)果與分析2.1母致死率測(cè)定由圖1可看出,在0～30s照射時(shí)間里,酵母致死率呈直線(xiàn)上升;30～40s時(shí),致死率達(dá)到95%～99%,40s后致死率近似100%。因此,選擇40s為誘變處理時(shí)間。2.2誘變菌株的篩選將誘變后的菌株在以乳酸為惟一碳源的LM上進(jìn)行初篩。由圖2可見(jiàn),在LM上菌落大小不等,其中少數(shù)菌落較大。由于菌落大的菌株利用乳酸原料的關(guān)鍵酶活性較高,即菌株具有較高的乳酸脫氫酶活性的可能性較大,而乳酸脫氫酶是酵母高級(jí)醇及雙乙酰代謝的關(guān)鍵酶,為此本研究挑選菌落較大的菌株。將挑選的菌株在MCM上進(jìn)行培養(yǎng),由圖3可見(jiàn),誘變菌株在MCM上生長(zhǎng)的菌落大小及溶鈣圈也有差異。菌落小的菌株溶鈣圈小,生長(zhǎng)活力低;菌落大小和溶鈣圈均為適中的菌株,生長(zhǎng)活力居中,發(fā)酵平穩(wěn),產(chǎn)酸性能也較為適中。在乳酸培養(yǎng)基上加TTC進(jìn)行顯色,由圖4可見(jiàn),誘變菌株紅色深淺不同。由于酵母產(chǎn)酒精能力越強(qiáng),顯現(xiàn)的紅色越深,因此對(duì)照?qǐng)D3挑選出25株紅色相對(duì)較深的菌株進(jìn)行復(fù)篩。2.3不同程度中乳酸和乳酸含量對(duì)比經(jīng)初篩得到的菌株(除Y0404外)發(fā)酵5d后,發(fā)酵液中高級(jí)醇含量比對(duì)照都有不同程度下降,幅度為0.8%～13.2%;而乳酸含量均有提高,幅度為10.3%～21.8%(表1)。本研究選擇高級(jí)醇含量低而乳酸含量高的菌株(Y0401,Y0402,Y0403,Y0705,Y1105,Y1110)進(jìn)行下一步篩選。2.4y1110菌株的篩選將復(fù)篩挑選出的菌株進(jìn)行啤酒發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明,Y1110菌株的高級(jí)醇含量低于其余菌株和CK,而實(shí)際發(fā)酵度與對(duì)照接近(表2),為此選擇Y1110菌株為目標(biāo)菌株。2.5y1110菌株對(duì)-氨基氮的利用由表3可知,菌株Y1110在發(fā)酵過(guò)程中,與對(duì)照相比高級(jí)醇含量顯著降低(P<0.05);由外觀濃度可見(jiàn),對(duì)照菌株開(kāi)始利用糖類(lèi)較快,到后期兩者基本一致;而對(duì)α-氨基氮的利用,兩者基本一致。說(shuō)明對(duì)照菌株發(fā)酵開(kāi)始生長(zhǎng)較為旺盛,因而高級(jí)醇、雙乙酰產(chǎn)量較高;后期Y1110菌株活性較強(qiáng),其開(kāi)始積累的高級(jí)醇較少,后期還原能力也較好,雙乙酰降低。與對(duì)照相比,Y1110菌株乳酸脫氫酶活性在發(fā)酵開(kāi)始后上升較快,特別在發(fā)酵第3、第4兩天差異顯著(P<0.05),因而形成的乳酸含量也較多,兩菌株間差異顯著。乳酸和高級(jí)醇的胞內(nèi)合成都需要還原性輔酶(NADH),對(duì)同一原料的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致酵母中高級(jí)醇的合成下降。2.6發(fā)酵菌株的確定將Y1110和對(duì)照菌株同時(shí)進(jìn)行啤酒釀造試驗(yàn)。表4結(jié)果顯示,誘變菌株發(fā)酵得到的啤酒高級(jí)醇顯著降低(P<0.05),雙乙酰也有所降低。而發(fā)酵度、酒精度等其他指標(biāo)及風(fēng)味、口感基本不變。2.7釀酒菌株的發(fā)酵活性測(cè)定將菌株Y1110在MM斜面上連續(xù)接種培養(yǎng)8代后,進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定。表5結(jié)果顯示,傳代前、后菌株的主要釀造性能基本上沒(méi)有變化,無(wú)顯著差異;而兩者與對(duì)照均有顯著差異(P<0.05)。因此,所獲得的菌株Y1110遺傳穩(wěn)定性較好。3高級(jí)醇的合成本研究中,目標(biāo)菌株高級(jí)醇的產(chǎn)率低于對(duì)照,而主發(fā)酵期乳酸脫氫酶活性和乳酸產(chǎn)率均高于對(duì)照,分析表明兩者之間存在一定的因果關(guān)系。啤酒酵母細(xì)胞中高級(jí)醇有兩條形成途徑:合成途徑和分解途徑。合成途徑是在葡萄糖經(jīng)EMP、TCA等合成氨基酸的途徑中,中間體α-酮酸經(jīng)進(jìn)一步還原得到相應(yīng)的高級(jí)醇;分解途徑是由氨基酸脫氨分解產(chǎn)生高級(jí)醇。大部分低碳鏈高級(jí)醇是通過(guò)合成代謝途徑產(chǎn)生的,高級(jí)醇中75%的異戊醇、異丁醇和活性戊醇是由糖形成的。乳酸脫氫酶是酵母細(xì)胞內(nèi)催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化的酶,反應(yīng)是可逆的,需要丙酮酸和還原性輔酶。在高級(jí)醇的糖源合成途徑中,也需要經(jīng)過(guò)丙酮酸進(jìn)一步合成高級(jí)酮酸,由還原性輔酶得到高級(jí)醇。有些物質(zhì)對(duì)酵母的呼吸及NADH氧化酶活性有抑制作用,如二硫氰基甲烷,可能會(huì)影響高級(jí)醇的形成。在啤酒發(fā)酵的主酵期,酵母生長(zhǎng)旺盛,對(duì)糖的利用快,細(xì)胞內(nèi)丙酮酸和還原性輔酶充足,促使高級(jí)酮酸形成并進(jìn)一步被還原成為高級(jí)醇;目標(biāo)菌株乳酸脫氫酶活性顯著增加,丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)變,使乳酸積累增加,消耗丙酮酸和還原性輔酶,造成高級(jí)醇的合成量下降,這與本研究中表3的結(jié)果一致。主酵期后乳酸脫氫酶活性恢復(fù)到與對(duì)照相同,由于反應(yīng)的可逆性,乳酸的含量也隨后恢復(fù)到與對(duì)照相同;但高級(jí)醇的合成反應(yīng)是不可逆的,而且主要在主酵期形成,繼續(xù)保持比對(duì)照低的水平。因此選育乳酸脫氫酶增加的菌株,來(lái)獲得低含量高級(jí)醇啤酒酵母的方法從理論上是可行的。在目標(biāo)菌株的篩選中,可靠靈敏的篩選系統(tǒng)是該方法的關(guān)鍵。本研究第一步采用以乳酸為惟一碳源的培養(yǎng)基篩選,可獲得乳酸脫氫酶活性較高的菌株;其次,采用麥芽汁-碳酸鈣平板篩選,通過(guò)溶鈣圈的大小反映菌株的產(chǎn)酸性能,以保持啤酒風(fēng)味不變;再用TTC檢驗(yàn)菌株的發(fā)酵性能,