啤酒酵母分離培養(yǎng)技術(shù)的研究

啤酒酵母分離培養(yǎng)技術(shù)的研究

啤酒發(fā)酵母的分離和栽培是采用特殊的分離技術(shù)，從原菌中分離優(yōu)良強大的發(fā)酵母植物，拓展和生產(chǎn)。啤酒酵母的分離培養(yǎng)對啤酒酵母的優(yōu)良性狀及其純度具有決定性作用,因為菌種的純粹程度和強壯程度,將直接影響到啤酒發(fā)酵液的口味、風(fēng)味和發(fā)酵速度,關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量,關(guān)系到企業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益,是整個生產(chǎn)的命根子。而酵母菌和其他微生物一樣,易受外界條件的影響而常常發(fā)生變異、混雜或衰老,因此,生產(chǎn)中要保持產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定,需經(jīng)常對酵母菌株進行分離培養(yǎng),以保持酵母菌的強壯和純粹。1等著分離的理由1.1從實驗室保存的原菌種中分離,原菌種必須先經(jīng)過幾次培養(yǎng)活化后再分離。1.2從生產(chǎn)中的酵母泥或主發(fā)酵液中分離。2和直線分離培養(yǎng)法啤酒酵母分離培養(yǎng)的方法較多,工廠中常用的是平板分離培養(yǎng)法和劃線分離培養(yǎng)法。這兩種方法比較簡單,但不一定能獲得單一純種,如果需要,還可以以平板分離培養(yǎng)法或劃線分離培養(yǎng)法獲得的菌落出發(fā),進一步采用單細(xì)胞分離法,選出若干菌株,進行選擇。2.1稀釋液的制備這種方法簡單易行,適合于工廠現(xiàn)場使用?？蛇M行兩次平板分離,以期不是單細(xì)胞的菌落形成機率減小到最低限度。用無菌水將待分離的酵母原菌種制成10-1～10-5稀釋液,分別吸取10-1～10-5稀釋液1ml注入已編好號的10-1～10-5的無菌培養(yǎng)皿中。將融化后冷卻至45℃左右的麥汁瓊脂培養(yǎng)基,倒入加有稀釋液的各培養(yǎng)皿中10～15ml,迅速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)基和稀釋液充分混合,平放待其凝固后,置于25～27℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3天,每天檢查菌落生長情況,剔除形態(tài)上有改變的菌落,選擇菌落形態(tài)正常、細(xì)胞大小均勻的菌落進行培養(yǎng)。必要時應(yīng)進行2～3次重復(fù)分離。2.2菌種的分離此法與平板分離培養(yǎng)法相類似,劃線分離培養(yǎng)法是在固體培養(yǎng)基上通過劃線的方法,使接種到培養(yǎng)基表面的菌體數(shù)逐漸減少,起到菌數(shù)“稀釋”的作用,以達到分離出理想的單個菌落的目的。該方法較簡單,速度較快,但分離單細(xì)胞的機率較平板法為低。將麥汁瓊脂培養(yǎng)基融化并冷卻至45℃左右,倒入無菌培養(yǎng)皿中,旋轉(zhuǎn),凝固成平板,用滅菌后的接種環(huán)直接挑取已經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌液,在平板表面輕輕劃線,其劃線方法如圖2所示。在25～27℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3天,挑取劃線上的均勻單一菌落,用顯微鏡檢查形態(tài)認(rèn)可后,移植至斜面培養(yǎng)基上,待培養(yǎng)并進一步檢查后,確定選用與否。此法一般用于分離培養(yǎng)生產(chǎn)上已有的菌種。2.3個別分離和培養(yǎng)法單細(xì)胞分離培養(yǎng)借助于顯微鏡制成只含一個細(xì)胞的培養(yǎng)基滴,待形成菌落后移出。單細(xì)胞分離培養(yǎng)法中又分漢生氏法和林德納法。2.3.1蓋玻片移植法檢測細(xì)胞增殖用載玻片、玻璃環(huán)和刻有方格的厚蓋玻片組成培養(yǎng)濕室。將需要分離培養(yǎng)的酵母,用接種環(huán)移植到麥芽汁試管中,充分振蕩,使酵母細(xì)胞均勻分散于培養(yǎng)基中,取一滴帶酵母的培養(yǎng)液,涂在載玻片上。用顯微鏡檢查其中的酵母細(xì)胞數(shù),如細(xì)胞數(shù)不超過20個,即取一滴培養(yǎng)液滴在蓋玻片的內(nèi)面,均勻地涂在刻有方格的范圍里。然后在玻璃環(huán)周圍涂上明膠或凡士林,粘于載玻片上,環(huán)內(nèi)加一滴無菌水,以使環(huán)內(nèi)空氣濕潤,再將蓋玻片覆蓋在玻璃環(huán)上,周圍用明膠或凡士林將玻璃環(huán)與蓋玻片嚴(yán)密粘牢,如圖3所示。將做好的檢片,置于顯微鏡下,檢查每個小方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù),將只含一個酵母細(xì)胞的小方格位置,記在與蓋玻片畫有同樣格子的紙上以備檢查時使用。檢片必須同樣做三個以上,置于25～27℃恒溫箱中培養(yǎng)2天以上,每天定時鏡檢細(xì)胞生長情況。待單一細(xì)胞已發(fā)育成菌落后,比較各單一菌落的大小、形態(tài)和整齊程度,選擇優(yōu)良者,用接種環(huán)移植到已滅菌的麥芽汁試管內(nèi),使之增殖。每個菌落要接種3～4個試管。移植的菌落一般不少于10個。然后在25～27℃恒溫箱中培養(yǎng),并進行生理特性鑒定,選擇最優(yōu)者加以擴大培養(yǎng),供生產(chǎn)使用。2.3.2細(xì)胞檢片培養(yǎng)此法是由漢生氏單細(xì)胞分離培養(yǎng)法演變而來的。將準(zhǔn)備分離培養(yǎng)的酵母或發(fā)酵液,移植到已滅菌的麥汁培養(yǎng)基中,經(jīng)多次稀釋至每一滴麥汁僅含一個細(xì)胞為止。在無菌室中用接種環(huán)取稀釋液滴在蓋玻片上,或凹形載玻片孔內(nèi),可點3～5排,每排3～5個小點,點要均勻,距離要一致。將蓋玻片小心地翻轉(zhuǎn)過來,使有小滴的一面面向凹形載玻片的孔穴,穴內(nèi)加一滴無菌水,蓋玻片和載玻片間用凡士林密封。在顯微鏡下檢查每個小滴,鏡檢時應(yīng)小心移動焦距,防止兩個細(xì)胞重疊而發(fā)生誤解。將只有一個細(xì)胞的小滴位置記下,如圖4所示。將檢片置25～27℃恒溫箱培養(yǎng)2～3天,每天檢查酵母細(xì)胞生長情況。小滴培養(yǎng)每次應(yīng)做三個以上的檢片,經(jīng)過培養(yǎng)后,加以選擇。挑選發(fā)育正常的菌落,用滅菌的三角形濾紙,如圖5所示。把菌落吸出,連紙移入已滅菌的麥芽汁中,擴大培養(yǎng),經(jīng)生理特性鑒定后擇優(yōu)用于生產(chǎn)。2.4子囊孢子分離培養(yǎng)此法是溫蓋和勞斯特氏創(chuàng)造的方法。先將需要形成孢子的酵母置于石膏塊上,在恒溫箱中至少培養(yǎng)30小時,在無菌室或無菌箱內(nèi)把孢子接種到有蓋玻片的麥汁小滴內(nèi),再將蓋玻片放在特制的玻璃柜內(nèi)。分離孢子時采用兩根特制的顯微針,一根針的針尖直徑為7微米,由玻璃柜的一端插入;另一根針的針尖直徑為2.5微米,由玻璃柜的另一端插入。使用高倍顯微鏡及附帶顯微操縱器,利用顯微針切割一個子囊孢子壁,取出單個孢子,接種到事先準(zhǔn)備好的注有麥汁的蓋玻片上。這種顯微操縱器可以縮小手的移動距離幾千倍。單孢子的分離方法可分為5個階段,如圖6所示。待分離出來的孢子發(fā)芽產(chǎn)生菌落后,用經(jīng)滅菌的接種環(huán)移植到麥芽汁培養(yǎng)基試管內(nèi),進行擴大培養(yǎng),并進行酵母生理特性鑒定而決定是否取用。單孢子分離法是以一個酵母孢子出發(fā)培養(yǎng),可更準(zhǔn)確地培育出新菌株。此法在國際上比較流行,而在國內(nèi)很少使用。3污染不同細(xì)菌后，啤酒酵母的分離和繁殖3.1處理和分離培養(yǎng)基菌種室中保藏的酵母如果檢出有細(xì)菌污染,可以在分離培養(yǎng)基中加入抑制劑如土霉素,抑制細(xì)菌生長,長出酵母菌落。具體做法如下:YEG培養(yǎng)基:酵母膏5g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml、調(diào)pH4.5、0.1MPa滅菌20min。0.1%土霉素:用蒸餾水配制0.1%土霉素溶液,用細(xì)菌過濾膜過濾,備用。分離培養(yǎng)基:吸取1ml0.1%土霉素至無菌平皿中,注入10ml融化并冷卻至45℃左右的YEG培養(yǎng)基,混勻,凝固成平板。用生理鹽水適當(dāng)稀釋樣品的細(xì)胞懸液,吸取0.1～0.2ml接入分離培養(yǎng)基的平板上,涂布均勻,25～27℃培養(yǎng)2～5天,長出菌落均為酵母,接入斜面保存?zhèn)溆谩?.2發(fā)酵菌種的篩選吸取0.1～0.2ml適當(dāng)稀釋的樣品懸液,涂布在YEG或麥汁固體平板上,置于25～27℃培養(yǎng)2～5天,挑出100個菌落進行性狀測試。測試項目有:細(xì)胞形態(tài)、巨大菌落形態(tài)、凝聚性、發(fā)酵度、產(chǎn)孢能力、糖發(fā)酵能力及發(fā)酵性能試驗。只有和檔案中生產(chǎn)酵