microrna與腫瘤耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

microrna與腫瘤耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

1出現(xiàn)耐藥即發(fā)生耐藥腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病。1943年，耶魯大學(xué)的格倫納爾曼首次將二甲酯用于腫瘤化療，并打開了現(xiàn)代腫瘤化療的序幕。隨后新的抗腫瘤藥物不斷出現(xiàn),化療成為腫瘤主要的治療方法之一,但是如同細(xì)菌易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性一樣,腫瘤細(xì)胞也常對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性,而且更為普遍,成為導(dǎo)致化學(xué)治療失敗的主要原因之一。因此腫瘤耐藥是腫瘤治療急需解決的關(guān)鍵問題之一。腫瘤細(xì)胞群體具有內(nèi)在的、高度有序發(fā)展的抗藥能力,無論是細(xì)胞毒類藥物還是靶向藥物,均未能克服耐藥問題。腫瘤的耐藥性是影響化療療效和腫瘤根治的主要原因,至今僅有少數(shù)組織來源的晚期腫瘤,可以通過藥物治愈,而且即使是這些腫瘤,也可能復(fù)發(fā)并發(fā)生耐藥。腫瘤細(xì)胞的耐藥性包括原發(fā)性耐藥(intrinsicresistance)和獲得性耐藥(acquiredresistance)。原發(fā)性耐藥亦稱天然性耐藥、內(nèi)在性耐藥,指腫瘤的耐藥性是天然的,在腫瘤細(xì)胞用藥之前就已經(jīng)存在,化學(xué)治療對(duì)這些腫瘤的療效較差;多數(shù)腫瘤細(xì)胞的耐藥性屬于獲得性耐藥亦稱繼發(fā)性耐藥,是在化學(xué)治療過程中化療藥物誘導(dǎo)逐漸產(chǎn)生的。腫瘤細(xì)胞一旦產(chǎn)生耐藥性,化療藥物就不能發(fā)揮完全的抗癌作用殺死癌細(xì)胞,即使大多數(shù)的腫瘤被殺死,而這一小部分具有抗藥性的癌細(xì)胞依然會(huì)繼續(xù)生長,造成癌癥復(fù)發(fā)。進(jìn)而,化學(xué)治療療效越來越差,這是導(dǎo)致惡性腫瘤最終無藥可用的重要原因之一。此外,根據(jù)腫瘤的耐藥譜還可以分為原藥耐藥(primarydrugresistance)和多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)。前者是指腫瘤細(xì)胞只對(duì)開始接觸的原藥不敏感,而后者則除了對(duì)開始誘導(dǎo)的藥物有抗性之外,對(duì)其他未接觸過而且結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。這個(gè)概念是1970年最先由Biedler和Riehm提出的。腫瘤的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜,腫瘤的MDR與多藥耐藥基因(multi-drugresistantgenes)過表達(dá)密切相關(guān),最近的研究發(fā)現(xiàn),化療藥物以外的損傷因素也可以使多藥耐藥基因表達(dá)增強(qiáng),而這些損傷因素所引起的多藥耐藥基因的高表達(dá)均可以使細(xì)胞對(duì)后來的其他損傷因素產(chǎn)生耐受,因此,多藥耐藥基因應(yīng)改稱耐多種損傷基因似乎更能體現(xiàn)其內(nèi)涵。迄今為止,腫瘤的多藥耐藥是腫瘤治療尚未解決的難題之一。2非編碼rnas微小RNA(microRNA,miRNA)是長度約22個(gè)核苷酸(nucleotide,nt)的單鏈小RNA分子,其中21nt-23nt長度的miRNA占大多數(shù),約為84%(圖1)。屬于非編碼RNA(non-protein-codingRNAs,ncRNAs)的一種。非編碼RNA是基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中非蛋白編碼的部分,曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪聲”,主要包括miRNA、小干擾RNA(smallinterferingRNAs,siRNAs)、piwi蛋白相互作用RNA(PIWI-interactingRNAs,piRNAs)和長鏈非編碼RNA(longncRNAs,lncRNAs)。目前,這些最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在生物信息流由DNA模板向蛋白效應(yīng)分子轉(zhuǎn)化過程的多個(gè)層面發(fā)揮著不同形式的調(diào)節(jié)作用。最近的研究表明,miRNA對(duì)多基因表達(dá)的調(diào)控具有高效性和特異性,對(duì)靶基因的異常調(diào)控可能構(gòu)成腫瘤耐藥機(jī)制,是腫瘤耐藥復(fù)雜性調(diào)控的重要構(gòu)成部分。這些發(fā)現(xiàn)改變了“RNA僅僅是DNA和蛋白之間媒介”的傳統(tǒng)觀念。2.1mirna的編碼是一個(gè)顯著性研究的小miRNA是目前ncRNA中被研究的最多的成員,到目前為止,人們已在植物、線蟲、果蠅,動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了一萬五千多個(gè)miRNA,其中人類細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)的有1,048個(gè)。miRNA的命名原則:miRNA可簡寫成miR,再根據(jù)其被克隆的先后順序加上阿拉伯?dāng)?shù)字,如miR-22。一般而言,數(shù)字越小,發(fā)現(xiàn)越早;高度同源的miRNA在數(shù)字后加上英文小寫字母(a、b、c······),如miR-181a、miR-181b、miR-181c;位于基因組不同位點(diǎn)但具有相同成熟體序列的miRNA,應(yīng)在序列后添加短線和阿拉伯?dāng)?shù)字以示區(qū)別,如miRNA-34a-1、miRNA-34a-2;miRNA前體經(jīng)過一個(gè)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu),具備兩個(gè)臂,但通常只有一個(gè)會(huì)被選擇成為最終的miRNA,那么被降解掉的另外一條臂則以“*”表示;物種縮寫應(yīng)置于miRNA之前,如has、mmu和rno分別代表人、小鼠和大鼠;確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA應(yīng)保留原來名字,如lin-4。2.2莖環(huán)中間體---前體mirna的表達(dá)MiRNA可能來自于基因組的基因間隔區(qū)或者pre-mRNA的內(nèi)含子中,但是不論其來自何處,其加工成熟機(jī)制都是相同的。首先,在細(xì)胞核中,RNA酶IIIDrosha-DGCR復(fù)合體在miRNA原初轉(zhuǎn)錄物(primRNA)基部切割雙鏈形成60nt-70nt的5’末端具有磷酸基,3’末端具有二核苷酸突出(overhang)的莖環(huán)中間體---前體miRNA(pre-miRNA)。然后,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5通過識(shí)別pre-miRNA的3’端的二核苷酸突出信號(hào)而與premiRNA結(jié)合,依賴Ran-GTP將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)。植物中是由Exportin-5的同源物HASTY負(fù)責(zé)miRNA前體的輸出。最后,Dicer識(shí)別pre-miRNA雙鏈的5’末端磷酸及3’末端突出,在距莖環(huán)大約兩個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角處切斷螺旋體的雙鏈,產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)類似于siRNA的二聚體,其中成熟的miRNA來自于pre-miRNA的一條臂,pre-miRNA的另外一條臂產(chǎn)生一個(gè)長度與miRNA相同的片段,即miRNA*。在經(jīng)過切割和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)后,RNA解旋酶作用于miRNA:miRNA*二聚體,其中miRNA進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)中發(fā)揮作用,miRNA*則被降解。2.3mir-33對(duì)植物中抗氧化酶基因表達(dá)的影響MicroRNA是通過與靶mRNA的3’-UTR堿基配對(duì)的方式來執(zhí)行對(duì)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯抑制的功能。在動(dòng)物中,microRNA與靶mRNA進(jìn)行不完全配對(duì)執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制的作用。但是如果動(dòng)物miRNA與靶序列完全互補(bǔ),則進(jìn)入RNA干擾路徑指導(dǎo)靶序列降解。在篩選果蠅生長缺陷突變株的過程中發(fā)現(xiàn)了Bantam基因座。該基因座編碼了果蠅幼蟲抑制程序性死亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的miRNA。BantammiRNA大量表達(dá)并抑制HidmRNA的翻譯。Hid是程序性死亡的主要激活因子。Bantam類似于線蟲的miR-80/82,這表明miR-80家族能控制線蟲的細(xì)胞死亡和增殖。動(dòng)物中的miRNA還能影響細(xì)胞分化。miR-23與Hes1基因具有較完全的互補(bǔ)性(大約77%)。Hes1是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu),它只在未分化細(xì)胞中表達(dá)。將人工合成的miR-23加到未分化的NT2神經(jīng)細(xì)胞中,可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的Hes1水平大幅下降。但是將人工合成的miR-23突變體加入到未分化NT2細(xì)胞中,Hes1水平保持不變,且其含量與將野生型miR-23加入到已分化的NT2細(xì)胞中是一樣的。這表明miR-23在翻譯水平上抑制Hes1基因的表達(dá),影響細(xì)胞分化。在植物中,由于miRNA與mRNA互補(bǔ)程度高,故可用來預(yù)測植物microRNA的靶位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,miRNA能直接指導(dǎo)靶mRNA的剪切。植物miRNA大多是調(diào)控發(fā)育與細(xì)胞分化的基因。miR-165/166的靶基因PHB與PHV中的序列發(fā)生突變后則造成功能獲得性突變,PHBmRNA表達(dá)的組織范圍相對(duì)于野生型PHBmRNA擴(kuò)大了。近來的研究發(fā)現(xiàn),植物中的miRNA不僅可以調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞分化,還對(duì)環(huán)境應(yīng)答和激素應(yīng)答有一定作用。miR-167和miR-160調(diào)節(jié)編碼植物激素應(yīng)答因子基因的表達(dá)。在擬南芥中,TIR1蛋白因子通過與E3泛蛋白連接酶SCF復(fù)合物的吲哚乙酸結(jié)合而參與胚軸分化、橫向根系形成等生理過程,而miR-393調(diào)控該蛋白的表達(dá)。3mir-482-3a靶向?qū)?-sf-z-b細(xì)胞毒性的影響腫瘤的耐藥機(jī)制復(fù)雜,目前,已知化療耐藥的分子機(jī)制包括:藥物靶點(diǎn)的改變、藥物的改變或失活、DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡減少、藥物代謝改變以及藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞核型改變等(圖2)。同時(shí),細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞死亡通路等亦與之密切相關(guān)。目前研究較多的包括與藥物外排相關(guān)的能量依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)體,如ABC家族的P170、MRP、BCRP、DNA修復(fù)系統(tǒng)如錯(cuò)配修復(fù)、細(xì)胞凋亡相關(guān)分子及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等。這些關(guān)鍵基因發(fā)生的一系列遺傳或表觀遺傳上的改變是導(dǎo)致耐藥性的主要機(jī)制之一。此類改變包括基因的突變(mutation)、缺失(deletion)、擴(kuò)增(amplification)、轉(zhuǎn)置(translocation)、DNA的異常甲基化以及microRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多種方式。其中,有研究揭示miRNA與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感程度密切相關(guān),miRNA成為腫瘤耐藥研究領(lǐng)域一個(gè)熱點(diǎn)。miR-214可靶向PTEN導(dǎo)致PTEN蛋白低表達(dá),Akt通路過度激活從而促進(jìn)細(xì)胞增殖,致使過表達(dá)miR-214的卵巢癌病人對(duì)順鉑不敏感。SIRT蛋白是依賴于NAD的蛋白去乙?；?通過對(duì)P53蛋白去乙?；鸬娇沟蛲鲎饔?在PC3細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a可下調(diào)SIRT1的mRNA,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞生長受到抑制并增強(qiáng)了PC3對(duì)喜樹堿的敏感度。miRNA的突變(mutation)、異常表達(dá)(misexpression)和異常加工均會(huì)影響miRNA的正常功能,導(dǎo)致靶基因的蛋白表達(dá)水平異常。如果此類靶基因與腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感程度相關(guān),將改變腫瘤細(xì)胞的藥物敏感程度(圖3和表1)。miR-482-3P靶向抑制NF-Yb轉(zhuǎn)錄水平,上調(diào)Top2a表達(dá),提高淋巴細(xì)胞型白血病CEM細(xì)胞對(duì)替尼泊苷的敏感性,而下調(diào)其表達(dá)則促使了CEM/VM-1-5的藥物耐受。Lu等報(bào)道胸甘酸合成酶3’UTR區(qū)6個(gè)堿基的缺失突變與胃癌患者對(duì)5-FU的化療敏感性有關(guān),但具體機(jī)制尚不清楚。Tsang的研究表明,let-7a通過下調(diào)細(xì)胞凋亡中的啟動(dòng)酶CASP3抑制了細(xì)胞凋亡,在A431和HepG2細(xì)胞中過表達(dá)let-7a可增強(qiáng)它們對(duì)阿霉素、紫杉醇及干擾素的耐藥性,抑制let-7a則增加化療藥物引發(fā)的細(xì)胞凋亡。4mirnna調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥研究MiRNA究竟通過何種機(jī)制對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感程度產(chǎn)生影響尚待研究。2007年,Bertino等提出了“miRNA的藥物基因組學(xué)”(miRNApharmacogenomics)概念,指出通過研究miRNA及miRNA的突變?nèi)绾胃蓴_miRNA的正常功能進(jìn)而改變患者藥物反應(yīng)程度,最終可找出某些特定的miRNA用以指導(dǎo)患者的個(gè)性化用藥。美國國立癌癥研究所對(duì)60種癌細(xì)胞系(NCI-60)進(jìn)行了10萬多種化學(xué)藥物的敏感性實(shí)驗(yàn),得到所有細(xì)胞系對(duì)各種藥物的藥敏數(shù)值GI50、LC50和IC50,同時(shí)對(duì)這60個(gè)細(xì)胞系做了DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平的多種分析,包括染色體畸變、DNA拷貝數(shù)變化、mRNA及miRNA的表達(dá)譜分析,所有數(shù)據(jù)被整合在CellMiner中,為在分子水平系統(tǒng)性研究腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性提供了數(shù)據(jù)支持。MiRNA藥物基因組學(xué)的最終目標(biāo)是通過分析患者的miRNA及mRNA特征譜,再結(jié)合其他分子標(biāo)志,可以預(yù)測患者對(duì)某種藥物的反應(yīng)程度,從而因人而異的給予最有效的化學(xué)治療。通過研究miRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥性,探索miRNA在人類腫瘤治療中的潛能具有現(xiàn)實(shí)意義。p53是眾所周知的抑癌基因,然而P53相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子P63/P73在鱗癌中均過表達(dá)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)化療可以引發(fā)P63/P73依賴性miR-193a-5p的誘導(dǎo),從而通過miRNA介導(dǎo)的P73的反饋性抑制以限制化療敏感性。抑制miR-193a可中斷該反饋,抑制離體和在體腫瘤細(xì)胞的生存并增強(qiáng)化療敏感性。因此在P53缺失腫瘤中,miR-193a的抑制或可提供新的治療機(jī)會(huì)。RNAi技術(shù)的發(fā)展為miRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥起到了重要意義,如應(yīng)用反義核酸技術(shù)下調(diào)miR-21,使miR-21表達(dá)減少可以增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)拓?fù)涮婵档拿舾行?。研究發(fā)現(xiàn)miR-200c抑制-微管蛋白3(classIII-tubulin,TUBB3)表達(dá),過表達(dá)miR-200c可恢復(fù)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。MiR-203過表達(dá)通過抑制靶基因AKT2的活性,下調(diào)其下游耐藥相關(guān)蛋白MTDH/HSP90的表達(dá),從而增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。在MDR大腸癌中miR-222與ADAM-17的表達(dá)成負(fù)相關(guān),提高HCT116/L-OHP和HCT-8/VCR細(xì)胞中miR-222的表達(dá)量可降低ADAM-17蛋白表達(dá),使細(xì)胞凋亡增加,進(jìn)而改善大腸癌HCT116/L-OHP和HCT-8/VCR細(xì)胞對(duì)L-OHP/VCR的敏感性。腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells,CSCs)具有廣泛的增殖和自我更新潛能以促進(jìn)癌癥的發(fā)展。研究顯示let-7和miR-181在肝細(xì)胞CSCs中表達(dá)上調(diào)。還表明let-7靶向作用于SOCS-1和CASP3,而miR-181則靶向作用于RASSF1A、TIMP3及NLK。Let-7的抑制可增加肝細(xì)胞CSCs對(duì)多柔比星和索拉非尼的化療敏感性,而miR-181沉默可減弱肝細(xì)胞CSCs的活躍性和侵襲性。最新研究發(fā)現(xiàn),miR-503可能通過抑制藥物外排,負(fù)調(diào)控腫瘤耐藥相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而逆轉(zhuǎn)肺腺癌A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。5mirnna調(diào)節(jié)機(jī)制目前miRNA在腫瘤耐藥性中的研究尚處于起步階段,許多具體作用機(jī)制還需深入的研究證實(shí),有的研究之間甚至存在矛盾之處。Zhu等報(bào)道了miRNA-451和miRNA-27a在多藥耐藥的癌細(xì)胞系A(chǔ)2780DX5和KB-V1中表達(dá)上調(diào),抑制miR-451或miR-27a的表達(dá)可導(dǎo)致MDR1的mRNA和蛋白水平的下降,從而增強(qiáng)細(xì)胞系對(duì)長春堿、阿霉素的敏感程度。但Kovalchuk等研究結(jié)果顯示,在多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/DOX中過表達(dá)miR-451可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性