抗腫瘤抗體藥物的研究進展

抗腫瘤抗體藥物的研究進展

抗蟲藥物是指以細胞工程技術(shù)和互補基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的抗蟲劑技術(shù)制備的藥物。其具有特異性高、性質(zhì)均一及針對特定靶點定向制備等優(yōu)點?？贵w藥物主要用于惡性腫瘤、免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)、感染性疾病和心血管疾病等的治療,特別是其對腫瘤治療的應(yīng)用前景備受關(guān)注。當(dāng)前,抗體藥物的研究與開發(fā)已經(jīng)成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域研究的熱點,居近年來所有醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品之首。這些抗體包括利妥昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥單抗、異貝莫單抗、托西莫單抗、貝代單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗和塔西單抗等,其中抗腫瘤抗體藥物占多數(shù)。1免疫藥物的應(yīng)用抗腫瘤抗體藥物跟抗體藥物一樣經(jīng)歷了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體的發(fā)展,抗體藥物向低抗原性、高特異性方向發(fā)展。美國食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)已經(jīng)批準上市了41種治療型及診斷型抗體藥物,全球抗體藥物市場收益,2010年達550億美元,比2000年的21億美元增長近27倍,近十年的時間抗體產(chǎn)業(yè)增長之迅猛,產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。第一代抗體藥物源于動物多價抗血清,主要用于一些細菌感染性疾病的早期被動免疫治療。但其異源性引起的較強的人體免疫排斥反應(yīng)限制了這類藥物的應(yīng)用,因而逐漸被抗生素類藥物所代替。第二代抗體藥物是利用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體及其衍生物。因單克隆抗體具有良好的均一性和高度的特異性而在實驗研究和疾病診斷中得到了廣泛應(yīng)用。1986年FDA批準了世界上第一個單抗治療性藥物——抗CD3單抗OKT3進入市場,用于器官移植時的抗排斥反應(yīng)。但因其鼠源性而產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)從而降低療效,甚至可引起過敏反應(yīng)。因此,研究者進行了以下兩方面的改進:一方面在給藥途徑上改進,如使用小型化抗體、偶聯(lián)同位素、局部用藥等使鼠源性抗體用量減少;另一方面,改造鼠抗體,得到人源化抗體、基因工程抗體和人源抗體。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及抗體基因結(jié)構(gòu)的明了,DNA重組技術(shù)開始用于抗體的改造,制備各種形式的重組抗體。抗體藥物的研發(fā)進入了第三代,即基因工程抗體時代。新型基因工程抗體不斷出現(xiàn),如人源化抗體、單價小分子抗體(Fab’、單鏈抗體、單域抗體、超變區(qū)多肽等)、多價小分子抗體(雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體)、某些特殊類型抗體(雙特異型抗體、細胞內(nèi)抗體、催化抗體、免疫脂質(zhì)體)及抗體融合蛋白(免疫毒素、免疫粘連素)等。Jones等開發(fā)了人源化抗體,通過基因工程手段將鼠源的抗原互補決定區(qū)嵌入人抗體骨架中。1996年至2010年間進入臨床研究的人源化單克隆抗體中45%用于治療腫瘤,雖然人源化抗體的免疫原性大大降低,仍然會出現(xiàn)人抗人源抗體(humananti-humanantibody,HAHA)反應(yīng)。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程技術(shù)可將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來,并在噬菌體表面表達分泌,經(jīng)篩選獲得特異性抗體的噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn),代表著基因工程抗體的前沿,是生命科學(xué)的重大突破之一。隨著噬菌體展示技術(shù)以及由此衍生的E.coli展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)的發(fā)展,使人工合成全人源抗體成為可能,這類技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成為體外抗體篩選的主流技術(shù)平臺。2011年3月9日,美國FDA批準葛蘭素史克和人類基因組科學(xué)公司生產(chǎn)的Belimumab上市,用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療。Belimumab即為噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生的B淋巴細胞刺激因子特異性的人源單克隆抗體。在噬菌體抗體庫基礎(chǔ)上,近幾年又發(fā)展了核糖體展示抗體庫技術(shù)。利用核糖體展示技術(shù)篩選抗體的整個過程均在體外進行,不經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化的步驟,因此可以構(gòu)建高容量、高質(zhì)量的抗體庫,更易于篩選高親和力抗體。核糖體展示抗體庫技術(shù)代表了抗體工程的未來發(fā)展趨勢。另外,Lonberg的研究表明除了利用單細胞生物構(gòu)建的人源抗體篩選庫獲得全人源抗體外,轉(zhuǎn)基因動物也是此類抗體的重要來源。2抗腫瘤藥物的分類和特性2.1抗體fab按抗腫瘤抗體藥物結(jié)構(gòu)可將其分為4類:1)抗體,也稱裸抗體。根據(jù)其人源化的程度,又可分為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體。2)抗體片段,包括Fab’、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體等。3)抗體偶聯(lián)物,由抗體或抗體片段與“彈頭”藥物連接而成。可用作“彈頭”的物質(zhì)有放射性核素、化學(xué)治療(化療)藥物和毒素。這些“彈頭”物質(zhì)與抗體連接,分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。4)抗體融合蛋白,由抗體片段和活性蛋白兩部分構(gòu)成。2.2耐藥抗體藥物的特征抗體藥物有以下幾個特點:1)具有高親和性和特異性,使得抗體藥物高效特異性地發(fā)揮靶向治療作用。2)半衰期短,平均為10～21d,從而減少了使用次數(shù),易被患者接受。3)多樣性,主要表現(xiàn)為靶抗原的多樣性,抗體結(jié)構(gòu)(抗原互補決定區(qū)氨基酸序列變化)的多樣性和作用機制的多樣性以及“彈頭”化合物的多樣性。4)制備抗腫瘤抗體藥物的定靶性;即根據(jù)需要利用基因工程技術(shù)制備具有不同治療作用的抗體藥物?？梢葬槍μ囟ǖ陌蟹肿?定向制備相應(yīng)的抗體;也可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)的“彈頭”藥物或效應(yīng)分子,制備相應(yīng)的免疫偶聯(lián)物或融合蛋白。3抗體與細胞間的作用抗體類藥物發(fā)展是基于腫瘤細胞表面抗原或腫瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)與研究,抗原與抗體的高親和力和高特異性的相互作用可以改變細胞一系列功能,如抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、改變免疫系統(tǒng)功能等?？贵w藥物治療腫瘤的原理大致可分為以下幾種:1)抗體直接作用,如通過與抗原結(jié)合來抑制或阻斷細胞內(nèi)信號通路,誘導(dǎo)細胞凋亡;2)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞死亡,如抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)、補體依賴的細胞毒性作用(complementdependentcytotoxicity,CDC)以及T細胞功能調(diào)節(jié),其中抗體的Fc段主要是通過ADCC和CDC機制來殺死腫瘤細胞的;3)抗體與一些特殊的藥物分子或放射性小分子偶聯(lián),通過抗原抗體特異性結(jié)合,將藥物小分子攜帶到靶位點,從而抑制或殺死腫瘤細胞。以上機制已在臨床治療中得到應(yīng)用,但臨床試驗表明抗原的篩選和抗體的優(yōu)化是十分必要的,如需要篩選出腫瘤特異性抗原、提高抗體藥物中抗體親和力和特異性、抗體藥物人源化、降低抗體藥物毒性等。4抗癲癇藥物的發(fā)展趨勢4.1與b細胞誘導(dǎo)的雙靶向藥物evp1、vegf的聯(lián)合用藥隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的深入了解,人們從分子、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面將腫瘤病因?qū)W、預(yù)防和治療很好地連貫起來。腫瘤發(fā)病的分子機制包括關(guān)鍵基因、調(diào)控分子和受體等,目前針對表皮生長因子受體、血管生成因子受體的單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制藥和基因治療已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床常見腫瘤,成為臨床腫瘤學(xué)最突出的亮點?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的已上市的單克隆抗體藥物,有針對腫瘤細胞增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的利妥昔單抗、曲妥珠單抗、吉非替尼、厄洛替尼、伊馬替尼、埃克替尼和西妥昔單抗,以及針對腫瘤新血管生成的貝伐珠單抗等一大批分子靶向藥物。利妥昔單抗是一種人鼠嵌合性單克隆抗體,能特異性地與跨膜抗原CD20結(jié)合。CD20抗原位于前B和成熟B淋巴細胞的表面,而在造血干細胞、前前B細胞、正常漿細胞或其他正常組織不表達。95%以上的B細胞性非霍奇金淋巴瘤細胞表達CD20。利妥昔單抗與B細胞上的CD20抗原結(jié)合后,啟動介導(dǎo)B細胞溶解的免疫反應(yīng),從而殺死腫瘤細胞。這些抗腫瘤抗體藥物都是針對單一的靶點,但是腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程,從單一靶點對腫瘤治療是遠不夠的。臨床經(jīng)驗顯示,早期單靶點的分子靶向藥物在應(yīng)用一段時間后,腫瘤細胞通過突變等途徑很容易出現(xiàn)對這些藥物的耐藥。這就啟發(fā)人們研制多靶點的藥物來提高抗癌效果。從2005年以來臨床研究證實,索拉非尼等多靶點藥物可使晚期腎癌患者的無進展生存期延長一倍。而阻斷其他通路的藥物,如注射用的mTOR抑制藥替西羅莫司和口服的mTOR抑制藥依維莫司,相繼在2007年和2010年也獲FDA批準上市。非小細胞肺癌的靶向治療除了吉非替尼和厄洛替尼等單靶點藥物以外,凡德他尼和索拉非尼也在進行臨床試驗,初步結(jié)果令人鼓舞。2009與2011年,生物制藥巨頭Genentech公司基于“two-in-one”策略,相繼開發(fā)了同時靶向VEGF與HER2,以及同時靶向EGFR與HER3的雙特異性抗體,療效明顯優(yōu)于針對單個靶標的單抗治療,在國際上引起強烈反響。左明輝等于2012年研制出一種同時結(jié)合VEGF,EGFR,HER2的Fc融合蛋白EVP1,是一種富有潛力的多靶向抗體類治療腫瘤藥物。作者將高效結(jié)合VEGF的FLT1的特定結(jié)構(gòu)域(第2個IgG樣結(jié)構(gòu)域)、高效結(jié)合EGFR家族成員的herstatinC末端的79個氨基酸(HERIN)與經(jīng)點突變改造后的人IgG1Fc融合。實驗表明,構(gòu)建獲得的融合蛋白EVP1與VEGF,EGFR,HER2的親和力常數(shù)Kd分別達到0.63,4.55及18.7nmol/L,EVP1與VEGF的親和力高于阿瓦斯汀(Kd≈1.8nmol/L),與EGFR,HER2的親和力分別略低于艾比特思(Kd≈0.39nmol/L)、曲妥珠單抗(Kd≈5nmol/L)。EVPI與雙特異性抗體相比,結(jié)合不同靶標的單元相對獨立,在結(jié)合一類抗原(如VEGF)后仍保持結(jié)合另一類抗原(如EGFR)的活性,可能具有更強的協(xié)同效應(yīng);結(jié)合的抗原范圍更廣(包括VEGF以及除HER3之外的所有EGFR家族成員),適合幾乎所有類型腫瘤的治療;選用的Fc段經(jīng)過功能區(qū)的突變改造,能介導(dǎo)更強的、抗體依賴性的、細胞介導(dǎo)的細胞毒性效應(yīng),具有更長的體內(nèi)半衰期;構(gòu)成融合蛋白的各肽段均來源于人體天然蛋白,免疫原性低,不易產(chǎn)生中和抗體。因而,該融合蛋白具有潛在的抗腫瘤臨床應(yīng)用價值。4.2抗為體藥物的應(yīng)用盡管有多種抗腫瘤抗體藥物上市,但因價格昂貴,一般家庭難以承受,故抗體藥物銷售量有限。因此,人們努力尋找能夠降低價格的新型抗腫瘤抗體藥物。其途徑主要有兩種:一種是抗腫瘤抗體藥物的小型化,因為小型化抗體藥物不需要糖基化修飾,可以在原核細胞中表達,操作方便,生產(chǎn)成本較低;另一種是抗腫瘤抗體藥物的高效化,即抗體連接上對腫瘤細胞有強烈殺傷作用的“彈頭”,降低藥物的用量,減少治療費用。綜合這兩種方法所產(chǎn)生的抗腫瘤抗體藥物往往會獲得更好的效果?？贵w藥物小型化研究表明,鼠源性完整的抗體可誘發(fā)人抗鼠抗體免疫反應(yīng),臨床應(yīng)用效果不佳,小型化抗體刪除了Fc段,使抗體免疫原性大大降低。此外,單克隆抗體及其偶聯(lián)物均為大分子物質(zhì),難以通過毛細血管內(nèi)皮和細胞外間隙到達實體瘤深部的腫瘤細胞。因此,研制小型化抗體藥物對提高療效有重要意義。小型化抗體可以用酶降解或基因工程手段獲得,包括Fab片段、單鏈抗體、雙特異抗體、三價抗體、微型抗體等?？贵w藥物高效化研究主要是利用與惡性腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的具有關(guān)鍵作用的分子靶點,研制小型化抗體藥物,提高對實體瘤的穿透性;還利用高效“彈頭”藥物,與抗體制成化學(xué)偶聯(lián)物或基因工程融合蛋白,從而提高抗體藥物對腫瘤細胞的作用強度。目前高效小型化抗體藥物已經(jīng)取得重大進展。高度有效的“彈頭”藥物已被連接到許多能識別不同腫瘤抗原的抗體上,吉妥單抗(卡利奇霉素與抗體偶聯(lián)物)的成功上市使得抗體藥物的用量下降了10余倍。目前已有10多種抗腫瘤抗體偶聯(lián)物在臨床研究階段,其中SGN-35正在進行I期臨床試驗,以探討其對于霍奇金淋巴瘤的治療作用,II期臨床研究針對系統(tǒng)性間變性大細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和CD30陽性惡性血液病。已有少數(shù)放射性抗體偶聯(lián)物(包括異貝莫單抗和托西莫單抗)獲得FDA批準用于臨床腫瘤治療。首個被批準的是澤娃靈(zevalin),用于治療非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma,NHL),批準的治療方案是澤娃靈與利妥昔單抗(rituxan)配伍應(yīng)用于對標準化療無效或單用利妥昔單抗治療的NHL病人。放射性抗體偶聯(lián)物對一些抗體耐藥的腫瘤有效,目前有15種以上該類藥物處于臨床研究階段。迄今,大多數(shù)免疫毒素在血液腫瘤治療中取得成功,有20多種高效小型化免疫毒素處在臨床研究階段,用于血液惡性腫瘤和實體腫瘤的治療。高效小型化抗腫瘤抗體藥物制備方便、用藥量少、物美價廉,將展現(xiàn)出巨大潛力與廣闊的應(yīng)用前景。4.3抗體組藥物的研究有助于完善藥物研究體系抗體組學(xué)是在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)基礎(chǔ)上,結(jié)合鼠、兔、人雜交瘤技術(shù)及基因工程抗體技術(shù),經(jīng)過抗體靶標高通量篩選、建立大規(guī)?？贵w庫、大規(guī)模高通量篩選、優(yōu)化,最終應(yīng)用于研究、診斷及治療的抗體的一門新興學(xué)科。傳統(tǒng)抗體藥物的研發(fā)是基于單基因、單蛋白和單個抗體水平,首先需要十多年時間研究此基因和蛋白是否可作為抗體藥物的靶標。隨著基因組計劃的完成和蛋白組學(xué)的發(fā)展,越來越多的新基因、新蛋白被發(fā)現(xiàn);而隨著生物信息學(xué)、蛋白組學(xué)、功能基因組學(xué)和計算機科學(xué)的快速發(fā)展,以及高通量、自動化、微量化DNA測序技術(shù),基因組數(shù)據(jù)庫及其分析軟件、生物芯片技術(shù)、高通量基因或藥物篩選技術(shù)的出現(xiàn),為抗體組學(xué)的創(chuàng)建及抗體組藥物研究體系的創(chuàng)建提供了條件?？贵w組藥物以高通量、整體化、信息化和系統(tǒng)化為特點,大大提高了抗體藥物的研發(fā)速度,縮短了藥物的研發(fā)周期;由于抗體組藥物的篩選利用了基因芯片、蛋白芯片和組織芯片等高通量技術(shù),因此減少了研發(fā)成本和風(fēng)險,同時既可獲