低產(chǎn)蛋白酶a啤酒酵母的誘變選育

低產(chǎn)蛋白酶a啤酒酵母的誘變選育

許多文獻表明，酶a是影響純生酒精泡沫穩(wěn)定性的重要因素。降低純生酒精中的酶含量，可以解決泡沫穩(wěn)定性問題。盡管國內(nèi)外啤酒研究者相繼發(fā)表了大量關(guān)于從工藝措施降低蛋白酶A的研究報告,但是在啤酒釀造時,只有選用產(chǎn)蛋白酶A活性低的酵母菌株,才能從根本上解決純生啤酒泡沫衰減問題。因此選育低產(chǎn)蛋白酶A菌種對于改善純生啤酒泡沫性能至關(guān)重要。本試驗采用甲基磺酸乙酯(EMS)對啤酒酵母進行化學(xué)誘變,最終得到低產(chǎn)蛋白酶A的優(yōu)良菌株,遺傳5代,測其發(fā)酵性能,表明遺傳性狀穩(wěn)定。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和熒光底物出發(fā)菌株:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒部;甘油培養(yǎng)基:2%甘油,1%蛋白胨,1%酵母浸粉,2%瓊脂;甲基磺酸乙酯(EMS):Sigma;熒光底物(MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-leu-Lys(Dnp)-NH2):PeptideInstitute;牛血紅蛋白:Sigma。1.2主要設(shè)備熒光分光光度計:F-4500,日立;氣相色譜儀:AutoSystemXL,PerkinELmer;紫外-可見分光光度儀:島津。1.3方法1.3.1細胞培養(yǎng)挑取麥汁斜面上保存的啤酒酵母一環(huán),接入5mL麥汁培養(yǎng)液中,28℃培養(yǎng)24h。吸1mL培養(yǎng)的酵母液于無菌離心管中,3500r/min離心5min,收集細胞,無菌水同樣條件離心洗滌2次。懸浮細胞于1mL無菌磷酸緩沖液(pH7.0)中,加40μLEMS原液,振蕩分散細胞,分別置于30℃搖床培養(yǎng)20,30,40,50,60min;3500r/min離心5min,棄去上清液,5%Na2S2O31mL洗滌2次,再懸浮細胞于1mL無菌水中,然后稀釋到10-3,取0.2mL稀釋液涂布于YPD平板,28℃培養(yǎng)2～3d。1.3.2過濾方法(1)總糖酸變性染色蛋白2挑取上述誘變后YPD平板上生長的菌落,轉(zhuǎn)移至甘油平板28℃培養(yǎng)3～4d,激活蛋白酶A,將10mL覆蓋液(瓊脂2%,0.3%酸變性血色蛋白)均勻倒于平板,37℃培養(yǎng)2～3d;然后在每個平板平鋪10%三氯醋酸1～2mL,終止反應(yīng)。根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值的大小判斷其水解酸變性血色蛋白的能力,比值越小說明蛋白酶A的活力越低。(2)發(fā)酵終止測定復(fù)篩采用三角瓶發(fā)酵法,挑取上述斜面低溫保藏菌種一環(huán);接入10mL麥汁培養(yǎng)液中,28℃培養(yǎng)24～48h;再將活化好的試管中菌液全部接入裝有300mL無菌麥汁的三角瓶中,發(fā)酵栓密封,12℃發(fā)酵9d,記錄每日失重量,當(dāng)當(dāng)日失重量在0.2g以內(nèi)表明發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵液蛋白酶A活力、雙乙酰還原能力(根據(jù)雙乙酰含量反應(yīng)酵母的雙乙酰還原能力)和風(fēng)味物質(zhì)含量。1.3.3突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗挑取一環(huán)保存在麥汁斜面上的突變株轉(zhuǎn)接至新的麥汁斜面,共傳5代,對第5代突變株按照1.2.3(2)的試驗方法進行三角瓶發(fā)酵試驗,評價突變株的遺傳穩(wěn)定性。1.3.4分析定義器(1)死亡率致死率=100%?存活菌數(shù)活菌總數(shù)×100%=100%-存活菌數(shù)活菌總數(shù)×100%(2)熒光強度測定和樣品預(yù)處理活力測定:采用熒光底物法。取1500μL磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液(pH5.3)于一玻璃試管中,加入1368μL去離子水,加入待測樣品120μL,最后加入濃度為1mol/L熒光底物12μL。試樣混合均勻,放入30℃水浴鍋中,反應(yīng)30min后,再放入80℃滅活5min,快速冷卻到室溫,用熒光分光光度計測量熒光強度,激發(fā)波長λex=328nm,發(fā)射波長λem=393nm。樣品除氣(成品啤酒)或雙層濾紙過濾(發(fā)酵液),空白樣品用去離子水代替樣品。蛋白酶A活力降低率的計算:①出發(fā)菌株酶活的相對值=出發(fā)菌株的酶活力值-空白酶活力值;②突變株酶活的相對值=突變株的酶活力值-空白酶活力值;突變株酶活的降低率=出發(fā)菌株酶活的相對值?突變株酶活的相對值出發(fā)菌株酶活的相對值×100%突變株酶活的降低率=出發(fā)菌株酶活的相對值-突變株酶活的相對值出發(fā)菌株酶活的相對值×100%本試驗所測蛋白酶A活力以熒光值表示。(3)發(fā)酵力以每天的CO2失重量計算出總失重量來衡量發(fā)酵力。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制頂空氣相色譜法.將5mL發(fā)酵液裝入20mL頂空瓶中,蓋上膠塞,用鋁制瓶塞密封,自動進樣。結(jié)果分析用試樣的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(或峰高比值),查工作曲線,或使用回歸方程計算出試樣中各物質(zhì)含量。色譜柱與色譜條件:毛細柱:PEG2M0.25mm×30m(SGE);固定相:Chrornosorbl03,60～80目;柱溫:50℃;氣化室和檢測器溫度:240℃;載氣(高純氮)流量:40mL/min;氫氣流量:30mL/min;空氣流量:400mL/min;頂空進樣量:1mL。2結(jié)果與分析2.1雙致死率結(jié)果根據(jù)1.3.1試驗方法分別用EMS處理酵母懸浮液20,30,40,50,60min,所得致死率結(jié)果如圖1所示。一般認為致死率在70%～80%左右獲得正突變菌株的機率最高。由圖1可得,EMS處理30min時的致死率在70%～80%范圍內(nèi),因此確定EMS最佳誘變條件為:在磷酸緩沖液(pH7.0)條件下,濃度40μL/mL、處理時間30min。2.2選拔結(jié)果2.2.1復(fù)篩酵母菌生長結(jié)果如圖2所示,從酸變性血紅蛋白平板上生長的40株酵母菌株中,挑選出10株透明圈直徑與菌落直徑比值小于出發(fā)菌株的突變株,進行復(fù)篩。2.2.2突變株與出發(fā)菌株的熒光值比較對10株初篩突變株進行三角瓶發(fā)酵試驗,測定發(fā)酵液中蛋白酶A活力,結(jié)果如表1所示。由表1可得,突變菌株E07、E09、E10、E25和E30的熒光值低于出發(fā)菌株,蛋白酶A活力與出發(fā)菌株X相比,低于出發(fā)菌株。所以選用這5株突變菌株再次進行三角瓶發(fā)酵驗證試驗。2.3三角瓶發(fā)酵試驗2.3.1突變菌株的確定發(fā)酵力是酵母菌株發(fā)酵能力的重要衡量指標(biāo),快速有效的發(fā)酵才能適用于大批量的啤酒生產(chǎn)。對5株產(chǎn)蛋白酶A低的突變菌株進行三角瓶發(fā)酵驗證試驗。測定其發(fā)酵力,結(jié)果如圖3所示。由圖3可得,與出發(fā)菌種相比較,突變株E10發(fā)酵能力高于出發(fā)菌株,E25降糖速度較慢,其發(fā)酵力較差,其它突變株降糖與出發(fā)菌株基本一致。2.3.2e06、e5添加量、e基層對菌株降糖能力的影響發(fā)酵液雙乙酰含量及主要風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果如表2所示。由表2可得,突變株E07雙乙酰含量低于出發(fā)菌株,表明其雙乙酰還原能力強于出發(fā)菌株。突變株E25異戊醇含量遠低于出發(fā)菌株,原因可能是其降糖能力差所致。其它菌株各風(fēng)味物質(zhì)含量與出發(fā)菌株基本一致。2.3.3其他突變株酶活測定結(jié)果如表3所示。由表3可得,突變菌株E10的蛋白酶A活力降低21.92%,其余突變株酶活降低不顯著或出現(xiàn)升高現(xiàn)象。綜上,通過對突變株發(fā)酵能力等各方面綜合能力的評價可知,突變菌株E10發(fā)酵力較強,雙乙酰還原能力表現(xiàn)正常,風(fēng)味指標(biāo)與出發(fā)菌株相比基本一致,并且蛋白酶A活力降低顯著,選其為目的菌株進行遺傳穩(wěn)定性試驗。2.4出發(fā)菌株與出發(fā)菌株的篩選結(jié)果如表4所示。由表4可見,第5代突變株E10蛋白酶A活力顯著低于出發(fā)菌株,降糖能力和雙乙酰還原能力與出發(fā)菌株相比基本一致,風(fēng)味指標(biāo)與出發(fā)菌株相比表現(xiàn)出酯高醇低的趨勢,在保持出發(fā)菌株優(yōu)良性狀的同