全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)小鼠鼻型過敏反應(yīng)的初步研究

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)小鼠鼻型過敏反應(yīng)的初步研究

鼻子內(nèi)粘膜的感知神經(jīng)（或n）是感知傳導(dǎo)路徑中的第一個(gè)神經(jīng)元。或n具有特殊的電生化學(xué)特性。細(xì)胞細(xì)胞有不同的離子通道，在接收和傳播聽覺信息方面發(fā)揮著重要作用。對(duì)ORN的電生理學(xué)特性的研究,有利于弄清嗅覺產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的機(jī)制,并為嗅覺障礙的研究和治療奠定基礎(chǔ)。自1976年膜片鉗技術(shù)誕生以來,利用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行電生理學(xué)的研究已成為一種重要的研究手段。本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)小鼠急性分離的ORN的電生理學(xué)特性進(jìn)行了初步研究和探討。1材料和方法1.1酶活劑Ringers液(mmol/L):NaCl140,KCl5,CaCl21,MgCl21,葡萄糖10,HEPES10,丙酮酸鈉1。pH7.2,用1mmol/L的NaOH調(diào)節(jié)。電極內(nèi)液(mmol/L):KCl145(CsCl145,用于阻斷鉀電流),HEPES10,ATP1,MgCl24,EGTA0.5,GTP0.5。pH7.4,用1mmol/L的KOH或CsCl調(diào)節(jié)。酶液配制:用無Ca2+、Mg2+Ringers液稀釋胰蛋白酶,濃度為1mg/mL,放于-20℃冰箱備用,每次用前解凍。終止用細(xì)胞培養(yǎng)液:90%達(dá)而伯克改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM),10%胎牛血清,pH7.3～7.4。1.2全細(xì)胞膜片鉗的制備選用生后7～14d的昆明小鼠(由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),雌雄不限。將小鼠斷頭處死,剪開雙側(cè)鼻腔外側(cè)壁,并于解剖顯微鏡下取出嗅區(qū)黏膜置于Ringers液中清洗2～3次,將黏膜組織剪成1～2mm大小的組織塊。清洗后的嗅黏膜置于含0.1%胰蛋白酶的離心管中,室溫(20～24℃)下孵育消化8～15min,消化完畢后,吸出酶液,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,巴氏管輕柔吹打,吸出細(xì)胞懸浮液置于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上。靜止貼壁30～45min后,用Ringers液小心更換蓋玻片上的液體,在倒置相差顯微鏡(Olympus,Japan)下選擇胞膜光滑、胞體折光性好、活性良好的ORN進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。膜片鉗記錄時(shí),玻璃管微電極內(nèi)加入電極內(nèi)液,細(xì)胞置于Ringers液中。對(duì)于不同年齡的小鼠,在消化過程中可以適當(dāng)調(diào)整酶濃度或酶解時(shí)間,以獲取更多活性良好的ORN。1.3全細(xì)胞記錄模式采用兩步法拉制玻璃微電極(硅硼玻璃,薄壁),電極尖端0.5～2μm,阻抗為2.8～4MΩ。在微操縱儀的推動(dòng)下,將玻璃微電極尖端接觸ORN細(xì)胞膜,并應(yīng)用負(fù)壓抽吸使電極尖端和細(xì)胞膜形成高阻封接,封接電阻達(dá)到1GΩ以上,使膜片與周圍環(huán)境形成電化學(xué)隔離。予以快電容補(bǔ)償(C-fast)。待高阻封接形成穩(wěn)定后,應(yīng)用負(fù)壓抽吸,使吸附于電極尖端的一小片細(xì)胞膜破裂,即“破膜”。此時(shí)電極內(nèi)液與細(xì)胞外液相通,形成了全細(xì)胞記錄模式。補(bǔ)償慢電容(C-slow)及串聯(lián)電阻(R-series)后,從微電極處引出的全細(xì)胞電流通過膜片鉗放大器(Axopatch200B,AxonInstruments,USA)輸入計(jì)算機(jī),應(yīng)用pClampex8.1專用軟件進(jìn)行采樣分析。通過設(shè)定不同的實(shí)驗(yàn)程序,可以記錄到不同鉗制電壓下通道電流的幅度、激活和失活電流的峰值和時(shí)程以及膜電容、串聯(lián)電阻、輸入電阻及電容時(shí)間常數(shù)等生理特征和參數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)均在室溫條件(22～25℃)下進(jìn)行。在全細(xì)胞電壓鉗記錄模式下,設(shè)定一定的刺激程序,記錄細(xì)胞的膜電容,并利用膜片鉗專用記錄軟件動(dòng)態(tài)記錄細(xì)胞膜電容的波動(dòng)趨勢。最后,用電流值除以膜電容得到電流密度。2結(jié)果2.1神經(jīng)突變也完整的活性良好的ORN細(xì)胞胞體呈圓形或橢圓形,直徑5～8μm,可見明顯的神經(jīng)突起,并在部分細(xì)胞的突起末端可見圓形小結(jié),稱為嗅泡(olfactoryknob),胞膜光滑,胞體折光性好,胞內(nèi)未見布朗運(yùn)動(dòng)(圖1)。本實(shí)驗(yàn)方法分離的ORN在室溫下5h內(nèi)可以滿足膜片鉗實(shí)驗(yàn)要求。2.2膜片記錄器在全細(xì)胞模式下,應(yīng)用不同的刺激程序,在ORN的胞體上成功記錄到電壓依賴性鈉、鉀電流。2.2.1外向電流的特性全細(xì)胞電壓鉗模式下,膜電位鉗制在-60mV,給予-70～+70mV的階梯去極化脈沖刺激,階躍5mV,刺激波寬100ms,刺激頻率0.25Hz,記錄不同電壓條件下細(xì)胞離子通道電流的變化情況。以上的刺激程序可以激發(fā)快速激活、快速失活的內(nèi)向電流和持續(xù)的外向電流(圖2),位于基線上方者為外向電流,反之為內(nèi)向電流。在ORN胞體上成功記錄到電壓依賴性的內(nèi)、外向混合電流。I-V曲線(圖3A)顯示內(nèi)向電流在-60～-50mV左右激活,-20～-30mV左右達(dá)最大值,+20mV翻轉(zhuǎn)。不同的刺激電壓,內(nèi)向電流亦呈非線性變化,表明內(nèi)向電流有電壓依賴性。在細(xì)胞外液中加入河豚毒(TTX)0.1μmol/L,內(nèi)向電流被完全阻斷,說明內(nèi)向電流主要由Na+介導(dǎo)。將鈉電流的I-V曲線通過Boltzman方程G=Gmax/{1+exp[(V-Vmid)/Vc]}進(jìn)行擬和(式中G為膜電導(dǎo),Gmax為最大膜電導(dǎo),Vmid為半數(shù)最大激活電位,Vc為曲線的斜率因子),可以得到鈉電流的激活曲線(圖3B),擬和結(jié)果顯示該電流的Vmid=(-34.8±0.8)mV,Vc=2.4±0.5。2.2.2延遲特性ia小鼠ORN的外向電流包括瞬時(shí)成分和延遲成分,I-V曲線(圖4)顯示,外向電流在-40mV左右激活,+70mV達(dá)到最大值。隨時(shí)間的推移和膜電壓的增加,外向電流呈非線性增加,表明外向電流有電壓依賴性。本實(shí)驗(yàn)記錄到的小鼠ORN的外向電流主要由瞬時(shí)K+電流(IA)和延遲整流K+電流(Ik)組成。IA具有快速激活、快速失活的特性,鉗制電位高于-40mV時(shí),該電流失活。將細(xì)胞鉗制于-100mV,給予-80～+60mV刺激,時(shí)程300ms,階躍20mV,可以得到包括瞬時(shí)和持續(xù)成分的外向電流(圖5A)。同一細(xì)胞鉗制在-40mV,給予-20～+70mV刺激,時(shí)程400ms,階躍10mV,外向電流的瞬時(shí)成分消失,僅有持續(xù)成分存在(圖5B)。延遲鉀電流具有激活緩慢、延遲失活的特性,其I-V曲線顯示ORN的延遲鉀電流與電壓的關(guān)系為非線性的,屬于延遲整流范疇。在電極內(nèi)液中用145mmol/LCsCl取代145mmol/LKCl,外向電流可以完全阻斷,由此證明了外向電流為鉀電流。電流密度曲線(圖6)顯示雖然不同ORN的大小不同,離子通道數(shù)目不同,但是電流密度差異不大。在某一固定的電壓下,每一個(gè)細(xì)胞的最大電流密度總是圍繞某一固定值波動(dòng)。3小鼠嗅感悟神經(jīng)系統(tǒng)離子通道的研究急性分離的細(xì)胞保持與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能,仍具有全套二倍體基因,接近于生理狀態(tài)。在理論上,酶能不可逆地破壞生物膜上的蛋白質(zhì),而離子通道本身就是蛋白質(zhì),因此,利用酶消化結(jié)合機(jī)械分離的嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞亦存在這樣的問題。本研究結(jié)果顯示,在一定的實(shí)驗(yàn)條件下,胰蛋白酶不會(huì)破壞細(xì)胞主要的Na+、K+通道,急性分離的嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞能較好保存主要通道的活性。作為嗅覺傳導(dǎo)途徑的初級(jí)神經(jīng)元,嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞具有接受外周嗅覺沖動(dòng)并將嗅覺信號(hào)向中樞傳導(dǎo)的作用。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)其離子通道進(jìn)行記錄和分析,可以了解該細(xì)胞膜上離子通道的活性及離子通道阻滯劑和藥物對(duì)通道活動(dòng)的影響。本研究采用全細(xì)胞電壓鉗技術(shù)對(duì)嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞胞膜上的離子通道進(jìn)行了記錄和研究,初步了解到急性酶分離的小鼠嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞胞膜上存在有對(duì)TTX敏感的鈉通道及包含有瞬時(shí)成分和持續(xù)成分并能被CsCl完全阻斷的鉀通道。鈉電流是神經(jīng)細(xì)胞興奮性的標(biāo)志,它的激活產(chǎn)生動(dòng)作電位的上升相,即使細(xì)胞極化。而鉀電流種類較多,不同的細(xì)胞可具有不同的鉀電流類型,在動(dòng)作電位的不同時(shí)相起不同的作用。電壓依賴性鉀通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性等生理功能中起重要作用,參與神經(jīng)細(xì)胞膜復(fù)極化,與動(dòng)作電位閾值及其產(chǎn)生、時(shí)程和發(fā)放頻率有密切關(guān)系,也可影響鈣內(nèi)流,調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。而小鼠嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞的瞬時(shí)鉀通道(IA)可以被4-氨基吡啶(4-AP,5mmol/L)及垂體腺苷酸環(huán)化酶促多肽(PACAP,40nmol/L)阻斷,該電流可以被不同的嗅覺信號(hào)分子調(diào)節(jié),并在細(xì)胞興奮性方面起重要作用。在嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞的胞體上還可以記錄到L型和T型的鈣電流,該電流亦參與形成動(dòng)作電位的上升相,在細(xì)胞的極化過程中起一定的作用,但在本研究中并未記錄到該電流,原因有待進(jìn)一步探