甘南藏羊不同種群微衛(wèi)星dna多態(tài)性分析

甘南藏羊不同種群微衛(wèi)星dna多態(tài)性分析

甘南地區(qū)是西藏的中心產(chǎn)地之一。西藏是甘南地區(qū)牧場養(yǎng)羊業(yè)的家庭羊。甘南藏羊?qū)儆诓莸匮?，對寒冷環(huán)境適應(yīng)性好。甘南藏羊、塔拉和秋季金是中國藏羊中的三個(gè)優(yōu)秀群體。分布地域不同，外觀和生產(chǎn)性能差異很大，但有其自身的特點(diǎn)?？倲?shù)超過200萬人。這是甘南高原人民主要的生產(chǎn)和生活材料。藏羊所在地由于高寒生態(tài)條件致使引進(jìn)羊種及其雜種不能適應(yīng),從而沒有使藏羊受到所謂“雜交改良”的威脅,而保留了藏羊完整的優(yōu)良基因庫。藏系綿羊是優(yōu)良的地方品種,是培育綿羊新品種的重要育種素材,有著巨大的開發(fā)潛力和廣闊的利用前景。目前,隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展,人們逐漸對藏羊優(yōu)良特性的了解以及藏羊肉產(chǎn)品等日益顯示出的市場潛力和競爭力看好,藏羊的研究也開始受到人們的極大關(guān)注。但由于藏系綿羊品種資源的保護(hù)受到資金、條件、效益等多方面的限制,保護(hù)利用力度不夠,品種退化嚴(yán)重,藏系綿羊的遺傳多樣性逐步減少,因此利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)對甘南藏系綿羊不同生態(tài)類群的遺傳距離進(jìn)行準(zhǔn)確的測定,評價(jià)其遺傳多樣性,揭示藏系綿羊的進(jìn)化,了解各群體間的親緣關(guān)系、遺傳分化、準(zhǔn)確區(qū)分類型,為定向培育新品種(系、群),合理開發(fā)利用甘南藏系綿羊遺傳資源,指導(dǎo)甘南藏系綿羊種質(zhì)資源的監(jiān)測和保護(hù)工作積累理論數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1新鮮血樣的制備本試驗(yàn)采用典型群隨機(jī)抽樣法,從甘南藏羊的中心產(chǎn)區(qū)分別采集3個(gè)類型藏羊的新鮮血樣,EDTA抗凝,-20℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)類型隨機(jī)采取不少于50個(gè)個(gè)體的基因組樣本,公畜不少于10%,兩代或三代內(nèi)沒有血緣關(guān)系,外貌特征明顯,血樣共計(jì)191份。本研究所用血樣采集地點(diǎn)和樣本數(shù)量見表1。1.2方法1.2.1提取的胎盤dna基因組DNA提取參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)用蛋白酶K和苯酚從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離高分子質(zhì)量DNA的方法,稍加改進(jìn)。1.2.2微衛(wèi)星標(biāo)記選擇所用8對引物由世界糧農(nóng)組織(FAO)推薦,可由GenBank查得(表2),由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.2.3變性材料560PCR反應(yīng)體系為20uL,PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,50～60℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。用10%的非變性PAGE凝膠進(jìn)行電泳,然后用銀染法進(jìn)行定影、顯色。1.3等位基因頻率和等位基因大小范圍使用ExcelMicrosatelliteToolkit計(jì)算等位基因頻率、等位基因大小范圍。多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)用Dispan軟件計(jì)算。2結(jié)果與分析2.1瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖1?；蚪MDNA為一條較為整齊的條帶,亮度較好,說明提取的DNA的純度較高,濃度較大,符合分子生物學(xué)試驗(yàn)要求。2.2pcr產(chǎn)物檢測2.2.1等位基因差別對瓊脂糖凝膠電泳的影響對選取的8個(gè)微衛(wèi)星座位進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結(jié)果如圖2所示。從圖中幾乎看不出等位基因之間的差別,這是因?yàn)橄嗖顗A基數(shù)較小,瓊脂糖凝膠電泳無法分辨所致。特異PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測時(shí)只會(huì)看到一條帶,根據(jù)DNAMarker來判斷所擴(kuò)增產(chǎn)物是否在該微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異性條帶區(qū)域之內(nèi)。2.2.2無效等位基因根據(jù)等位基因擴(kuò)增片段的大小判斷個(gè)體的基因型,分離出1條帶的為純合子,2條帶的為雜合子,無條帶為無效等位基因。部分微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如下,見圖3、圖4。從圖中可以看出,由于微衛(wèi)星引物的高度變異性和引物的非特異性擴(kuò)增,所得到的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖中有一些雜帶,但都較少較淺。這是PAGE的分辨率較高所致。2.3群體遺傳變化的檢測2.3.1明8個(gè)微衛(wèi)星座微信基因檢測利用MicrosatelliteToolkit軟件計(jì)算等位基因頻率,結(jié)果表明8個(gè)微衛(wèi)星座位在3個(gè)綿羊群體中共檢測出96個(gè)等位基因。平均每個(gè)位點(diǎn)檢測到等位基因數(shù)目為12個(gè),數(shù)目最多的位點(diǎn)是OarFCB128為17個(gè),片段范圍為107～153bp;最少的位點(diǎn)是MAF70為8個(gè),片段范圍為146～172bp。2.3.2群體基因數(shù)及多態(tài)信息含量由表3可以看出,8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在甘南藏羊3個(gè)群體中的平均有效等位基因數(shù)、平均多態(tài)信息含量及群體平均雜合度分別為9.902、0.876、0.896。2.4不同品種藏羊的聚類分析通過遺傳距離分析表明,甘南藏羊3個(gè)群體的遺傳距離分別為甘加羊和喬科羊之間0.2856,甘加羊和歐拉羊之間0.1982,歐拉羊和喬科羊之間0.1640。本研究運(yùn)用Dispan軟件,采用遺傳距離信息分別以NJ和UPGMA法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明,喬科型藏羊、歐拉型藏羊和甘加型藏羊聚到一起,且歐拉羊和喬科羊的距離最近。聚類結(jié)果與品種的地理分布、育成史、外貌特征及文獻(xiàn)記錄基本符合。3遺傳多樣性分析甘南高原分布的藏羊主要為草地型,據(jù)其地域和特性又分為歐拉型、甘加型和喬科型3個(gè)亞型,是甘南州草地養(yǎng)羊業(yè)的當(dāng)家羊種,對高寒環(huán)境具有良好的適應(yīng)能力。是在高原條件下經(jīng)過長期的自然和人工選擇形成的藏羊種群,成為我國綿羊遺傳資源的寶貴材料。近年來,隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和地方畜禽品種資源開發(fā)利用措施的實(shí)施,以及動(dòng)物種質(zhì)資源保存戰(zhàn)略的推行,發(fā)掘和開發(fā)利用地方畜禽良種有利于我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。甘南藏羊資源的保護(hù)和選育提高刻不容緩。就家養(yǎng)動(dòng)物的許多品種采用共同的遺傳標(biāo)記進(jìn)行測定,同基因的差別可以找出品種的基因流向,這方面的研究,即系統(tǒng)的研究。首先,它是資源評價(jià)的基礎(chǔ),因其可以確定品種范圍,判定品種歸屬性;其次,它可以估計(jì)某些基因資源在特定品種或群體中潛在分布的可能性,以便制定保持或發(fā)展品種特性的規(guī)劃。對一個(gè)品種從外型到基因遺傳結(jié)構(gòu)的分析,有利于綜合對其進(jìn)行評價(jià),以便為遺傳資源的保護(hù)提供可靠的依據(jù)。研究中所選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)要求盡可能地分布在各個(gè)染色體上,位點(diǎn)的選擇還考慮等位基因數(shù)目的多少,這樣就有可能提供更多的遺傳信息。每個(gè)位點(diǎn)的等位基因至少在4個(gè)以上才能較好地進(jìn)行遺傳分析,一般選擇等位基因數(shù)在5～19個(gè)的為宜,等位基因數(shù)太少,不能提供足夠的信息量,為以后的分析帶來不便。而多態(tài)信息含量(PIC)大于0.7的微衛(wèi)星位點(diǎn)為最好的遺傳標(biāo)記,因?yàn)檫@種情況下,雙親在該位點(diǎn)通常是雜合的,在其后代中可以觀察到等位基因分離。另外,擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷大小應(yīng)在100～300bp之間,片段太大,不容易獲得擴(kuò)增產(chǎn)物;太小,不利于結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。本研究參考聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和國際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)(ISAG)推薦的引物,選取了其中8個(gè)微衛(wèi)星引物,結(jié)果表明8個(gè)微衛(wèi)星座位在甘南藏羊3個(gè)綿羊群體中共檢測出96個(gè)等位基因。平均每個(gè)位點(diǎn)檢測到等位基因數(shù)目為12個(gè),因此所選微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性較好,可以用于甘南藏羊的遺傳多樣性評價(jià)。等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(H)和多態(tài)信息含量(PIC)等參數(shù)是描述群體內(nèi)遺傳變異的重要指標(biāo)。等位基因頻率是衡量動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)的主要指標(biāo)之一,是估計(jì)和比較遺傳變異的第一步。H和PIC都是群體內(nèi)遺傳變異的測度,其值的高低反映了群體內(nèi)個(gè)體的均勻度,若數(shù)值高,表明遺傳變異大,選擇潛力大;反之則群體的遺傳變異就小,選擇潛力小。從保種的角度來考慮,要保持品種的遺傳多樣性,只有PIC和H數(shù)值大,才能說明群體遺傳多樣性比較豐富。孫飛舟對多態(tài)信息含量和遺傳雜合度做了Spearman相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系極顯著(r=0.9938,P<0.0001),同時(shí)指出,這兩個(gè)指標(biāo)只要計(jì)算其中一個(gè)就可以大致反映群體的變異情況。根據(jù)等位基因頻率的計(jì)算表明,結(jié)果顯示8個(gè)微衛(wèi)星座位在3個(gè)綿羊群體中共檢測出96個(gè)等位基因。平均每個(gè)位點(diǎn)檢測到等位基因數(shù)目為12個(gè),數(shù)目最多的位點(diǎn)是OarFCB128為17個(gè),片段范圍為107～153bp;最少的位點(diǎn)是MAF70為8個(gè),片段范圍為146～172bp。多態(tài)信息含量(PIC)是衡量片段多態(tài)性的指標(biāo)。Botstein等首先提出了用多態(tài)信息含量(PIC)衡量基因變異程度:當(dāng)PIC>0.5時(shí),該位點(diǎn)為高度的多態(tài)位點(diǎn);當(dāng)0.25<PIC<0.5時(shí)為中度多態(tài)性位點(diǎn);當(dāng)PIC<0.25時(shí),為低度多態(tài)位點(diǎn)。在所檢測的8個(gè)微衛(wèi)星座位中,BM6506位點(diǎn)的多態(tài)信息含量最高,為0.898,最低的是MAF70位點(diǎn),為0.85。所選位點(diǎn)均為高度多態(tài)位點(diǎn),說明所選的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)可以很好地用來做綿羊群體的遺傳多樣性分析。所研究的甘南藏羊3個(gè)群體15個(gè)微衛(wèi)星座位的平均多態(tài)信息含量為0.876。表明本研究群體提供的遺傳信息較高,具有較大的利用潛力。本研究藏羊群體內(nèi)微衛(wèi)星座位之間的差異,如歐拉羊BM6506位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.881,而OarHH35位點(diǎn)為0.868,這種差異可能是該類群在長期的自然和人工選擇過程中,不同微衛(wèi)星座位所受的選擇壓的差異造成的。基因雜合度(H)又稱基因多樣度,反映各群體在多個(gè)位點(diǎn)上的遺傳變異,被認(rèn)為是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)。就相同的分子標(biāo)記而言,群體平均雜合度的高低反映了群體的遺傳一致性程度,群體雜合度越低,表明該群體的遺傳一致性越高,而群體的遺傳變異越少,群體遺傳多樣性越低。本研究表明,甘南藏羊的平均雜合度為0.896,大于0.5,說明甘南藏羊具有較高的群體雜合度,群體內(nèi)的遺傳變異較大,群體近交程度弱,具有豐富的遺傳多樣性。遺傳距離主要反映品種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,因此,精確估測品種間的遺傳距離,對于精確確立品種間的遺傳關(guān)系顯得非常重要。Takezaki等運(yùn)用適于傳統(tǒng)標(biāo)記形式的有限等位基因模式(LAM)和適于微衛(wèi)星標(biāo)記的同步突變模型(SMM)的研究表明,Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離比其他的距離適用性更廣,在分析親緣關(guān)系較近群體的進(jìn)