交聯(lián)劑的應(yīng)用與發(fā)展

交聯(lián)劑的應(yīng)用與發(fā)展

1固定生物組織隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和生物技術(shù)的發(fā)展，異體和異質(zhì)生物組織的應(yīng)用日益廣泛。許多的異種生物組織,如心臟瓣膜、血管以及韌帶等,已經(jīng)被普遍的應(yīng)用于各種的移植手術(shù)中。為了減少植入組織的免疫原性,提高所利用的生物組織的穩(wěn)定性和持久性,在使用前需對(duì)這些植入組織進(jìn)行處理,包括物理處理和化學(xué)處理。物理處理的方式主要有加熱、干燥、輻射(紫外線或γ射線),而化學(xué)處理就是應(yīng)用各種化學(xué)試劑——交聯(lián)劑——對(duì)生物組織進(jìn)行固定處理。通過交聯(lián)劑的化學(xué)修飾,減少了植入物的抗原性,提高了機(jī)械強(qiáng)變和抵抗受體組織降解的能力。在當(dāng)前的實(shí)際應(yīng)用中,較為常用的交聯(lián)劑有甲醛(formaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)、二醛基淀粉(dialdehydestarch)和環(huán)氧化合物(乙二醇-乙醚二環(huán)氧丙脂,ethyleneglycoldiglcidylether)等。這些化學(xué)合成的交聯(lián)劑在處理生物組織方面各有所長,但它們的一些缺點(diǎn)也是有目共睹的。①由于這些交聯(lián)劑都是化學(xué)合成的,其本身均具有很高或相對(duì)較高的細(xì)胞毒性。這導(dǎo)致了使用它們進(jìn)行交聯(lián)處理的生物組織在植入人體以后,在一定程度上影響了受體正常組織的生長,進(jìn)而影響了創(chuàng)口的愈合和功能的恢復(fù)。②無論是戊二酮或是環(huán)氧化合物,它們所交聯(lián)的生物組織(如心臟瓣膜)在植入后易產(chǎn)生鈣化現(xiàn)象。這就削弱了所交聯(lián)生物組織的機(jī)械強(qiáng)度,使植入物變脆、易碎,影響了植入物在受體內(nèi)的使用期限。由于化學(xué)合成的交聯(lián)劑存在著上述的兩大缺陷,研究人員一直對(duì)交聯(lián)劑進(jìn)行研究。一方面,通過各種途徑來努力的減少現(xiàn)有交聯(lián)劑的細(xì)胞毒性的鈣化現(xiàn)象的發(fā)生。另一方面,一些新型的交聯(lián)劑被逐步的認(rèn)識(shí)并應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之中,京尼平(Genepin)就是它們的代表。2新型涂料：京尼平2.1杜仲制作杜仲科京尼平是傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分之一,是從京尼平甙中分離、提純而獲得的。杜仲是屬于杜仲科的一種落葉喬木,為我國特產(chǎn),主要分布于中西部地區(qū)。在傳統(tǒng)中醫(yī)草藥學(xué)中以其樹皮入藥,性溫、味甘,京尼平和它的環(huán)烯醚萜化合物常被作為一種消炎利膽藥應(yīng)用于治療各種肝膽疾病(可以促進(jìn)膽汁的分泌)和感染癥狀。2.2京尼平的制備從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看,京尼平是一個(gè)雜環(huán)化合物(圖1),是一種環(huán)烯醚萜類的化合物,具有—OH、—COO-等多個(gè)活性官能基團(tuán)。有報(bào)道表明,京尼平能自發(fā)的與氨基酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng),并生成一種深藍(lán)色的色素,這種色素因其無毒性而被用于食品染料的制作。此外,京尼平也被用于酶的固定化和制備凝膠微膠囊。戊二醛分子內(nèi)的醛基官能團(tuán)首先與生物材料中的氨基酸(主要是蛋白質(zhì)中賴氨酸的ε氨基基團(tuán)或羥賴氨酰的殘留物)結(jié)合后生成共軛的西佛氏堿(Schiff’sbase),隨后2個(gè)戊二醛分子的醛基官能團(tuán)間發(fā)生醇醛縮合作用,網(wǎng)狀的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)結(jié)構(gòu)也隨著這一聚合作用的進(jìn)行而產(chǎn)生。京尼平的交聯(lián)機(jī)制尚不明確。根據(jù)以往的研究表明,京尼平能自發(fā)的與氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)并形成藍(lán)色色素,這種藍(lán)色色素中最簡單的復(fù)合物是一個(gè)1:1的化合物。據(jù)此推測(cè),京尼平首先自發(fā)與氨基酸反應(yīng)生成一個(gè)環(huán)烯醚萜的氮化物,隨后經(jīng)過一個(gè)脫水作用形成一個(gè)芳香族的單體,之后這一芳香族的單體可能由于基于自由基反應(yīng)的二聚作用而形成環(huán)狀的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)結(jié)構(gòu)。2.3手術(shù)的表面活性劑要想成為一種理想的、能夠應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的交聯(lián)劑,其首要的特點(diǎn)是能夠形成穩(wěn)定而持久的交聯(lián)制品。以豬動(dòng)脈瓣為例,因其在形態(tài)大小和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)上與人的瓣膜非常相似,所以常被作為一種瓣膜的替代品而應(yīng)用于瓣膜的置換手術(shù)。但是所有的這些替代品在植入人體以前,都需要經(jīng)過一些特定的交聯(lián)處理,來降低這些替代品的免疫原性和提高它們的抗降解能力,并盡可能的減少其發(fā)生鈣化現(xiàn)象的可能性。為此,國內(nèi)、外的許多研究人員對(duì)京尼平作為交聯(lián)劑的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究。2.3.1交聯(lián)劑的細(xì)胞毒性變性溫度是指物體的性質(zhì)發(fā)生改變時(shí)的溫度,是評(píng)價(jià)生物制品交聯(lián)特性的一項(xiàng)重要的指標(biāo)。各種交聯(lián)劑對(duì)生物制品的交聯(lián)處理均會(huì)提高它們的變性溫度,而變性溫度的提高表明交聯(lián)處理提高了制品的穩(wěn)定性。目前常用的測(cè)定變性溫度的方法為差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry),這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于膠原組織熱躍遷現(xiàn)象的研究。在一系列的體外測(cè)試中,與使用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)處理的生物制品相比,京尼平交聯(lián)處理后制品的變性溫度略低一些。但兩者與沒有進(jìn)行交聯(lián)處理的生物材料相比,均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。也就是說,京尼平能有效的提高所交聯(lián)生物制品的變性溫度,是一種有效的交聯(lián)劑。b)固定指數(shù)固定指數(shù)是評(píng)價(jià)交聯(lián)制品特性的另一個(gè)指標(biāo),是指交聯(lián)制品中未與交聯(lián)劑反應(yīng)的自由氨基酸基團(tuán)所占的百分比。通常這一指數(shù)是通過水合茚三酮試驗(yàn)來進(jìn)行測(cè)定的。在水合茚三酮試驗(yàn)中,自由氨基酸基團(tuán)的數(shù)量與溶液的吸光度是成正比的。實(shí)驗(yàn)表明,京尼平交聯(lián)處理后制品的固定指數(shù)隨著所使用的京尼平的濃度的增加而升高;而在相同濃度時(shí),京尼平與戊二醛的交聯(lián)指數(shù)不相上下。c)鈣元素含量鈍元素含量的高低,是鈣化現(xiàn)象發(fā)生與否的一個(gè)重要表征。京尼平交聯(lián)處理后制品的鈣元素含量,與其他交聯(lián)劑處理后的制品相比,兩者之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。且與未交聯(lián)處理前的制品相比較,也沒有出現(xiàn)顯著的差異。d)細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性包括交聯(lián)劑本身的細(xì)胞毒性及其交聯(lián)制品的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性的高低,對(duì)于植入性交聯(lián)制品與宿主組織之間的相容性有著很大的影響。顯而易見的,細(xì)胞毒性越低的交聯(lián)劑和它所交聯(lián)的生物組織,它們的組織相容性就越好。在植入宿主體內(nèi)后,它們所引發(fā)的炎性反應(yīng)程度就越輕,從另一方面講,也說是加速了縮主組織的生長和愈合。交聯(lián)劑的細(xì)胞毒性,是通過體外的鼠源性3T3成纖維細(xì)胞(BALB/3T3C1A31—1—1)細(xì)胞株的短期試驗(yàn)和長期試驗(yàn)來進(jìn)行評(píng)估的。短期試驗(yàn)是通過MTT試劑[3—(4,5—二甲基噻唑)—2,5—二苯基四唑溴化物],與活細(xì)胞發(fā)生特定的反應(yīng)來測(cè)定存活細(xì)胞的數(shù)量。長期試驗(yàn)則是測(cè)定使用交聯(lián)劑培養(yǎng)后的細(xì)胞,所能形成細(xì)胞集落的數(shù)量來評(píng)估細(xì)胞毒性的(集落形成試驗(yàn))。而對(duì)交聯(lián)制品細(xì)胞毒性的測(cè)定,是直接在其上面接種3T3細(xì)胞,培養(yǎng)后用顯微鏡進(jìn)行檢查。與目前使用的各種交聯(lián)劑相比較,京尼平作為交聯(lián)劑的最大的優(yōu)點(diǎn)就是低細(xì)胞毒性,各項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果也說明了這一點(diǎn)。通過MTT試驗(yàn)測(cè)定的交聯(lián)劑的細(xì)胞毒性顯示,京尼平的細(xì)胞毒性比戊二醛要小10,000倍。而通過細(xì)胞集落形成試驗(yàn)測(cè)定的細(xì)胞毒性顯示,暴露于京尼平的細(xì)胞的增殖能力大約是同樣暴露于戊二醛的細(xì)胞的5,000倍。而在對(duì)交聯(lián)制品的試驗(yàn)中,無論所使用的戊二醛的濃度為多少,戊二醛交聯(lián)制品上所接種的細(xì)胞無一存活;相反的,在培養(yǎng)3天后的京尼平交聯(lián)的制品上就布滿了3T3細(xì)胞,而且還觀察到了由這些細(xì)胞所產(chǎn)生的新生的膠原纖維。e)基因毒性基因毒性也是細(xì)胞毒性的一個(gè)方面,對(duì)交聯(lián)劑而言,也是其能否應(yīng)用于臨床的一個(gè)指標(biāo)。在一系列的體外實(shí)驗(yàn)中,通過姊妹染色單體互換試驗(yàn)(SCE試驗(yàn))和小核試驗(yàn)(MN試驗(yàn))能檢測(cè)交聯(lián)劑潛在的基因毒性。姊妹染色單體互換試驗(yàn)(SCE試驗(yàn))是通過測(cè)量染色體中,姊妹染色單體之間互換現(xiàn)象的出現(xiàn)數(shù)量,來評(píng)價(jià)所測(cè)試的交聯(lián)劑的潛在的使染色體斷裂的能力。數(shù)據(jù)表明,在使用濃度為50ppm以下的京尼平進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),其結(jié)果與陰性對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P>0.001)。而同樣濃度的戊二醛卻表現(xiàn)出了較強(qiáng)使染色體斷裂的能力,所觀察到的SCE數(shù)量與陰性的對(duì)照組之間存在著顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。小核是指兩個(gè)細(xì)胞核中較小的一個(gè),其中含有基因材料和繁殖功能;小核試驗(yàn)(MN試驗(yàn))是,通過計(jì)算培養(yǎng)后細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)和雙核細(xì)胞中小核的數(shù)量,來評(píng)價(jià)交聯(lián)劑對(duì)細(xì)胞分裂和遺傳復(fù)制的影響。從1ppm到50ppm,各濃度京尼平所培養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)都很相近,且與正常對(duì)照間無顯著的差異;而濃度大于0.0005ppm的戊二醛就會(huì)對(duì)細(xì)胞的有線分裂產(chǎn)生了一定影響。f)機(jī)械性能穩(wěn)定的機(jī)械性能,是交聯(lián)制品在植入人體后能正常的發(fā)揮其預(yù)期功能的保證。評(píng)價(jià)交聯(lián)制品機(jī)械性能的參數(shù)有:最終抗張強(qiáng)度、韌性、應(yīng)力松馳、斷裂形變以及組織模數(shù)等。在這些參數(shù)的測(cè)定中,京尼平交聯(lián)的制品與戊二醛交聯(lián)的制品間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,也就是說京尼平與戊二醛一樣能形成穩(wěn)定、耐用的交聯(lián)制品。需要特別指出的是,所有的這些機(jī)械性能的測(cè)定均是針對(duì)植入前的交聯(lián)制品,缺乏相應(yīng)的植入后機(jī)械性能的研究。而許多的研究結(jié)果表明,宿主的體內(nèi)環(huán)境對(duì)于植入的交聯(lián)生物制品的機(jī)械性能有著明顯的影響。g)生物相容性和降解性能生物相容性是生物材料能否植入人體的一個(gè)重要指標(biāo),如果交聯(lián)后的生物材料不能植入使用,則將大大影響其所適用的范圍。在兔子身上進(jìn)行的模擬植入試驗(yàn)表明,京尼平交聯(lián)制品的生物相容性要明顯的優(yōu)于戊二醛進(jìn)行交聯(lián)處理的制品。試驗(yàn)表明,在植入后1周左右,京尼平組、戊二醛組和未進(jìn)行交聯(lián)修飾的對(duì)照組均引起了一定程度的炎性反應(yīng)。隨后的時(shí)間內(nèi),京尼平組和對(duì)照組的炎性反應(yīng)程度逐漸減輕(即植入組織周圍浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)量逐步減少),直到第12周左右,兩組植入物的炎性反應(yīng)都完全消失了。而戊二醛交聯(lián)制品的炎性反應(yīng)就要持續(xù)更長的時(shí)間,約20周左右才會(huì)完全的消失。同樣的試驗(yàn)方法也被應(yīng)用于交聯(lián)制品降解性能的研究上。從試驗(yàn)結(jié)果看,在植入后第4周,未進(jìn)行交聯(lián)處理的幾丁聚糖顆粒就首先出現(xiàn)了降解的征兆。至植入后第12期,未交聯(lián)的幾丁聚糖已經(jīng)完全變成了一些小碎片,而戊二醛交聯(lián)的幾丁聚糖顆粒也從致密的顆粒開始變成一個(gè)松散的結(jié)構(gòu)。相對(duì)應(yīng)的,京尼平交聯(lián)的幾丁聚糖顆粒直到植入后第20周也沒有發(fā)現(xiàn)如何降解的現(xiàn)象。h)交聯(lián)制品的穩(wěn)定性在前文中已經(jīng)介紹了京尼平與戊二醛所交聯(lián)形成的不同的交聯(lián)結(jié)構(gòu),京尼平為環(huán)狀的交聯(lián)結(jié)構(gòu),而戊二醛為網(wǎng)狀的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。對(duì)兩者所交聯(lián)制品的自由氨基含量的測(cè)定表明,隨著時(shí)間的推移,京尼平和戊二醛交聯(lián)制品的自由氨基含量均明顯的增加(P<0.05);但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也指也,京尼平交制制品中自由氨基含量的增加,要明顯的小于戊二醛所交聯(lián)的制品(P<0.05)。同一試驗(yàn)的數(shù)據(jù)也表明,京尼平交聯(lián)的生物制品的最終抗張強(qiáng)度、變性溫度等均保持了穩(wěn)定。2.3.2京尼平與生物材料的交聯(lián)綜上所述,作為一種新型的交聯(lián)試劑,京尼平能夠形成穩(wěn)定、有效的交聯(lián)制品。而且與傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)劑相比,它還具有細(xì)胞毒性(基因毒性)低,生物相容性好和抗降解能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。然而,京尼平要想廣泛的應(yīng)用于生物制品的交聯(lián)處理,還有以下的一些地方需要加以改進(jìn)和提高。a)自發(fā)形成的深藍(lán)色素根據(jù)現(xiàn)有的研究表明,京尼平是一種有效的交聯(lián)試劑,且因其具有多個(gè)活性基團(tuán)而能對(duì)多種的生物材料進(jìn)行交聯(lián)處理。然而,由于其活潑的化學(xué)性質(zhì),它也能自發(fā)的與氨基酸(主要是賴氨酸、羥基賴氨酸和精氨酸)或蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng),生成一種多聚體的深藍(lán)色色素。這些深藍(lán)色素可以很簡單的被洗脫或溶解于有機(jī)溶劑。雖然這種深藍(lán)色素可以用作食用染料,但對(duì)交聯(lián)制品而言可能會(huì)對(duì)其外觀和色澤產(chǎn)生一定的影響,因而,在使用京尼平對(duì)生物材料進(jìn)行交聯(lián)處理時(shí)應(yīng)考慮所使用的京尼平與生物材料間的比例,盡可能使用較少反應(yīng)的京尼平的數(shù)量。b)來源和價(jià)格京尼平(Genipin)是由京尼平甙(Geniposide)水解獲得的,而京尼平甙是從傳統(tǒng)中草藥杜仲(Eucommia)中提取的活性成分。它也可以依據(jù)Bichi等人的方法合成獲得。1992年,日本首先從杜仲的果實(shí)中提取了杜仲甙類(環(huán)烯醚萜甙的三聚體四和四聚體)作為新藥,并確定了環(huán)烯醚萜甙的提取工藝。近幾年來,一些日本和中國臺(tái)灣的公司相繼將京尼平商品化,但其售價(jià)均較高。以中國臺(tái)灣的ChallengeBioproducts為例,他們生產(chǎn)的京尼平的售價(jià)折合成人民幣約4,000元/5g。而且前為止,祖國大陸還沒有能夠提供商品化京尼平的公司和廠家。如此高的價(jià)格,也在一定的程度上限制了京尼平的廣泛應(yīng)用。京尼平與戊二醛的綜合比較可以參見表1。3京尼平的天然交聯(lián)劑雖然京尼平在某些方面還存在著不盡如人意的地方,但其極低的細(xì)胞毒性