頂空固相微萃取法測定哈密瓜汁中揮發(fā)性芳香成分

頂空固相微萃取法測定哈密瓜汁中揮發(fā)性芳香成分

哈密瓜（cucumismello.var.receive）的吸引香味是其產(chǎn)品類別的重要評價指標(biāo)。哈密瓜屬熱敏性瓜果,在加熱處理數(shù)分鐘后其香氣成分便損失殆盡,且產(chǎn)生令人不愉快的蒸煮味,完全失去了其原有的風(fēng)味品質(zhì)特征,因此哈密瓜熱加工中的變味問題引起了風(fēng)味研究者的關(guān)注,成為該領(lǐng)域研究熱點和難點。采用不同提香方法會產(chǎn)生不同的分析結(jié)果。1971年Kemp等在用減壓蒸餾法提取的風(fēng)味濃縮物中檢出了大量的九碳醇類和醛類,只發(fā)現(xiàn)極微量的酯類和苯甲醛。1997年宛曉春等采用AmberliteXAD-2吸附新疆伽師瓜香氣,得到13種成分,主要是醇、醛、酮,酯類僅有2種,認為3,6-壬二烯醇、6-壬烯醇、苯甲醇及呋喃類物質(zhì)是哈密瓜風(fēng)味的主體成分。2004年馬永昆等采用固相微萃取方法對不同成熟度金皇后甜瓜汁的香氣進行富集,得到45種成熟金皇后甜瓜的揮發(fā)成分,初步確定9種成分為金皇后甜瓜的特征香氣。SPME方法應(yīng)用于哈密瓜香氣成分的研究相對較少,缺少SPME方法實驗參數(shù)的系統(tǒng)研究。在馬永昆研究工作基礎(chǔ)上,結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)對伽師瓜果汁香氣成分的實驗參數(shù)加以探討、優(yōu)化并對其可行性加以分析,確定出最佳萃取條件,并對哈密瓜果汁揮發(fā)性芳香物質(zhì)進行了系統(tǒng)分析和鑒定,以期建立快速、穩(wěn)定、高效的檢測手段和技術(shù),為今后建立不同品種哈密瓜香氣的色譜圖庫、科學(xué)評價鑒定哈密瓜的香氣品質(zhì)以及哈密瓜變味機理的研究提供參考。1材料和方法1.1儲備液的制備伽師瓜[哈密瓜(HamiMelon)的一種]采自新疆吐魯番地區(qū),選取大小和果色一致的果實,取果肉榨汁,200目濾網(wǎng)過濾,-18℃凍藏。庚醇、辛醛、壬醛、檸檬烯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、己酸丁酯(標(biāo)準(zhǔn)品,色譜純)上海愛普香料有限公司;乙酸乙酯(色譜純,純度大于99.5%);以上標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇(色譜純)分別配成一定濃度的儲備液備用;氯化鈉(分析純)。1.2gc/ms分析儀手動SPME進樣器美國Supelco公司;HP5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司;SP-3400氣相色譜北京分析儀器廠;榨汁機上海燦坤電器公司。1.3方法1.3.1固相微萃取器SPME頂空萃取:選取大小和果色一致的果實3個(約9kg),去皮榨汁并過濾待用。取果汁8mL放入15mL樣品萃取瓶中,加入2.4g氯化鈉,使其質(zhì)量濃度為0.3g/mL,內(nèi)標(biāo)及磁力轉(zhuǎn)子置于固相微萃取工作臺上預(yù)熱10min;將固相微萃取器的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子篩(Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene/Carboxen,PDMS/DVB/CAR)萃取頭通過瓶蓋聚四氟乙烯隔墊插入樣品萃取瓶的頂空,推出吸附頭使其暴露于萃取瓶頂空蒸汽中進行萃取。當(dāng)樣品萃取平衡后,縮回纖維頭,迅速將針管插入氣相色譜儀的進樣口,推出纖維頭熱解析3min,同時啟動氣相色譜儀采集數(shù)據(jù)。1.3.2進樣器2min色譜柱:HP-5毛細管柱(25m×0.2mm,0.11μm);升溫程序:40℃保持2min,以4℃/min升至75℃,以1℃/min升至80℃,以10℃/min升溫至230℃,保持3min;載氣(N2)流速1.0mL/min。進樣器溫度250℃;檢測器溫度250℃,無分流進樣。以色譜峰保留時間定性,以內(nèi)標(biāo)法定量計算。1.3.3質(zhì)量分析條件電子轟擊(EI)離子源;電子能量70eV;傳輸線溫度250℃;質(zhì)量掃描范圍m/z15~500。1.3.4萃取工藝條件的優(yōu)化定性:利用GC-MS進行定性,通過計算機檢索與NIST02質(zhì)譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照,并參照文獻、進行確認。定量:數(shù)據(jù)處理采用BF2002色譜工作站軟件。選擇庚醇為內(nèi)標(biāo),使其在哈密瓜果汁中的質(zhì)量濃度為20.4ng/mL,以哈密瓜果汁中代表性的香氣物質(zhì)測定它們對庚醇的響應(yīng)因子。哈密瓜果汁中鑒定出的醇類、酯類和醛類物質(zhì)的質(zhì)量濃度以相應(yīng)的真實物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)的相對響應(yīng)因子計算。根據(jù)方法的設(shè)計原理,SPME加熱溫度、萃取時間、鹽添加量被認為是影響目標(biāo)化合物在萃取膜上的萃取效率的主要因素。本實驗對上述條件進行三因素三水平的正交試驗,以峰面積為判定指標(biāo)進行直觀分析;在此優(yōu)化條件基礎(chǔ)上,進行方法線性范圍、回收率、檢出限等實驗。每個處理進行3次平行實驗,測定結(jié)果取其平均值。2結(jié)果與分析2.1哈密瓜果汁的萃取條件研究2.1.1單因素spme萃取效果測試2.1.1.飽和電解質(zhì)nacl溶液對萃取液的影響本實驗對添加電解質(zhì)——飽和NaCl溶液(2.4gNaCl,即0.3g/mL)、半飽和NaCl溶液(1.2gNaCl,即0.15g/mL)和不加NaCl溶液的哈密瓜果汁進行了對比。由圖1可以看出,除丁酸乙酯外,加入飽和電解質(zhì)NaCl溶液的樣品各組分的萃取量明顯高于半飽和NaCl溶液和不加NaCl溶液的樣品,所以實驗過程中采用NaCl用量為2.4g。當(dāng)往液態(tài)基體中加入NaCl等鹽類物質(zhì)時可以增大溶液的離子強度,降低基體對揮發(fā)性物質(zhì)的束縛,提高其中有機物的逸出活度,促進其從液態(tài)基體中揮發(fā)出來,吸附到纖維頭上,從而降低了該方法的檢測限,提高香氣成分的響應(yīng)值。從圖中還可以看出,除了丁酸乙酯外,隨著NaCl用量增大,大部分香氣成分萃取效果明顯提高,說明不同的揮發(fā)性物質(zhì)其揮發(fā)性對NaCl的用量存在著差異。2.1.1.熱反應(yīng)過程中最佳條件的確定固定采樣時間和氣相色譜條件的情況下,萃取溫度對吸附效果的影響如圖2所示。實驗比較了20、30、40、50、60℃不同溫度條件下對萃取效果的影響,由圖2可知,升高溫度可以增強香氣成分的萃取效果,但當(dāng)溫度超過50℃時,乙酸乙酯萃取量呈下降的趨勢,而壬醛、庚醇、檸檬烯還未達到吸附平衡。這是因為不同的香氣成分具有不同的物化性質(zhì),所以吸附的難易程度不同,達到吸附平衡的時間也不同。操君喜等對哈密瓜進行70℃熱處理后,經(jīng)鑒定全為C8~C40的烷烴類化合物,表明其風(fēng)味物質(zhì)全部喪失。考慮到升高溫度可能會引起哈密瓜果汁中香氣物質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化,所以適宜的萃取溫度為30~40℃。2.1.1.萃取時間的影響實驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)萃取溫度保持不變時,隨著萃取時間的延長,哈密瓜果汁中各組分的含量不斷上升,如圖3所示。但是當(dāng)萃取時間超過40min后,壬醛、乙酸乙酯的萃取效果呈下降趨勢,這是因為隨著時間的延長,吸附在纖維頭上易揮發(fā)的物質(zhì)得到解析。同時,由于時間的延長,果實中自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)析出,使纖維頭凝結(jié)水滴,從而大大降低了纖維頭對揮發(fā)性芳香物質(zhì)的吸附。所以最佳吸附時間為30~40min。2.1.2影響電解質(zhì)nacl萃取條件的因素采用L9(33)正交試驗,確定SPME萃取哈密瓜果汁芳香成分的最佳參數(shù)。選擇SPME萃取溫度(A)、萃取時間(B)、電解質(zhì)NaCl的用量(C)3個因素,其因素水平設(shè)計見表1。由表2可知,各因素影響主次順序為C>B>A,較優(yōu)水平組合為A2B3C3。最終確定最佳試驗條件為加入2.4g飽和電解質(zhì)NaCl(即0.3g/mL),40℃萃取40min。2.1.3spme萃取方法的精度和精度的測量2.1.3.峰面積相對響應(yīng)因子fais定量分析采用內(nèi)標(biāo)法,根據(jù)萃取后樣品中待測組分與內(nèi)標(biāo)之間的關(guān)系:Coi=FAisCosAi/As,(Coi待測組分含量;FAis峰面積定量相對響應(yīng)因子;Cos內(nèi)標(biāo)物含量;Ai待測物質(zhì)峰面積;As內(nèi)標(biāo)物峰面積)若內(nèi)標(biāo)物的含量恒定,則FAisCos/As恒定,待測組分含量與其峰面積成正比。選取2-甲基丁酸乙酯、辛醛、乙酸己酯、己酸丁酯制成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液加入到果汁中,用SPME方法測得其加標(biāo)回收率為86.8%~97.6%,如表3所示,說明方法準(zhǔn)確結(jié)果可靠。2.1.3.脫香果漿中各組分檢測分別取5個質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液,其中均含有20.4ng/mL庚醇內(nèi)標(biāo)物。分別加入到脫香果漿中,采用SPME與GC分析計算出各組分在8.24~217ng/mL測量質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系,最小檢測量為7.21ng/mL。各標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程均呈現(xiàn)一次線性,回歸方程中系數(shù)a、b及回歸系數(shù)R2如表3所示。2.2揮發(fā)性成分的組成分析應(yīng)用上述得到的HS-SPME-GC-MS最佳操作條件,對哈密瓜果汁GC-MS分析的總離子色譜圖如圖4所示。可以看出,各種香氣成分的峰尖且窄,相鄰峰均完全得到分離,說明實驗用氣相色譜和質(zhì)譜條件能滿足哈密瓜香氣成分分離的要求。采用固相微萃取技術(shù)分析哈密瓜果汁中的香氣成分,只需少量的原料即可得到滿意的結(jié)果。哈密瓜香氣成分的色譜圖上共鑒定出了42個揮發(fā)性芳香化合物,見表4。按峰面積計算,其含量占哈密瓜果汁揮發(fā)性成分的93%。它們由酯類、醇類、醛類和烯烴構(gòu)成,其中酯類有28種,醇類有5種,醛類有5種,烯烴類有3種,酸類1種。伽師瓜果汁香氣成分的峰面積占79.95%的是酯類,醇類占7.64%,醛類占2.94%和烯烴占2.50%。與文獻報道的哈密瓜芳香成分鑒定結(jié)果相比,主要揮發(fā)性芳香物質(zhì)組成基本一致。這些成分呈現(xiàn)出的似蜜香、花香、果香、醇香和清鮮香氣混合組成了伽師瓜獨特的香氣。根據(jù)Guadagni的香氣值理論和已知化合物的香氣閾值,哈密瓜香氣成分中峰面積大且香氣閾值低的成分對香氣的影響較大,它們很可能是特征香氣。乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯、壬醛是伽師瓜的主要香氣成分,占酯類峰面積50.7%的乙酸酯類對構(gòu)成伽師瓜的香氣有關(guān)鍵作用。馬永昆等采用SPME方法應(yīng)用PDMS萃取頭檢測了哈密瓜汁中的香氣成分,其中酯類有33種,醇類4種,醛類2種。本實驗使用PDMS/DVB/CAR50/30μm萃取頭對哈密瓜中的香氣成分進行富集,其中酯類有28種、醇類5種、醛類5種、烯烴類3種、酸類1種。結(jié)果表明PDMS/DVB/CAR三相復(fù)合萃取頭比單一極性的PDMS萃取頭具有更寬的極性范圍和更好的萃取效果。操君喜等從哈密瓜樣品中鑒定了12種成分,相對體積分?jǐn)?shù)最多的是呋喃類物質(zhì),酮類和酸類分別占17%和23%,確定酯類及呋喃醇是哈密瓜香味的主體成分。本研究的揮發(fā)性成分在種類和數(shù)量上與馬永昆有較大的差別,檢測手段的進步和品種的不同都可能是產(chǎn)生這種差異的原因。國內(nèi)關(guān)于SPME方法應(yīng)用于哈密瓜香氣成份的文獻中缺少對方法實驗參數(shù)的系統(tǒng)研究。本實驗結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)對伽師瓜果汁香氣成分的實驗參數(shù)萃取溫度、萃取時間、鹽添加量進行正交試驗,以峰面積為判定指標(biāo)進行直觀分析;并在此優(yōu)化條件基礎(chǔ)上,進行方法線性范圍、回收率、檢出限等實驗,較為系統(tǒng)的建立了一個SPME應(yīng)用于哈密瓜香氣成份分析的方法。本研究使用GC-MS鑒定哈密瓜果汁揮發(fā)性芳香物質(zhì)并根據(jù)Guadagni的香氣值理論和已知化合物的香氣閾值進行了系統(tǒng)分析。但是GC-MS作為一種間接的測量方法,并不能用來有效分析出所有香味活性的化合物,此外,GC-MS無法用來確定各種香味化合物對哈密瓜總體香味貢獻的大小,因而也就無法確定對哈密瓜香味起作用的一些關(guān)鍵香味化合物。氣相色譜-嗅聞技術(shù)(GC-O)是解決這些問題的一種理想的方法,在SPME方法的基礎(chǔ)上結(jié)合GC-O技術(shù)鑒別哈密瓜特征香味化合物及確定哈密瓜香味化合物的香味強度和作用是今后研究的重點。3萃取回收率及精密瓜大小確定了HS-SPME哈密瓜風(fēng)味物質(zhì)分析中應(yīng)用PDMS/DVB/CAR50/30μm萃取頭,加入飽和電解質(zhì)Na