掃描電鏡樣品制備

掃描電鏡樣品制備掃描電子顯微鏡生物樣品制備技術(shù)無論是透射電鏡或是掃描電鏡，樣品均處在電鏡鏡筒的真空之中。而大多數(shù)的生物樣品都是柔軟并且含大量水分的。因此，也和透射電鏡的樣品同樣，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前，必須對生物樣品作對應(yīng)的解決。掃描電鏡的功效諸多，不同的功效對樣品的規(guī)定不同。例如二次電子像與背散射電子像和吸取電子像對樣品的規(guī)定基本相似，而與X射線微分辨析對樣品的規(guī)定相差較遠(yuǎn)。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術(shù)。另外，由于樣品的性質(zhì)不同，其解決辦法和程序也有不同。重要分兩大類，一類為含水量少的硬組織，如毛發(fā)、牙齒及植物的花粉、孢子、種子等。這類樣品普通含硅質(zhì)、鈣質(zhì)，角質(zhì)，砝瑯質(zhì)和纖維素等成分，因此普通只通過表面清潔、裝臺(粘膠)、導(dǎo)電解決等簡樸過程即可進(jìn)行觀察。如要觀察其斷面或內(nèi)部構(gòu)造時(shí)，經(jīng)斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺、鍍膜解決，即可進(jìn)行觀察拍照。另-類為含水分較多的軟組織，如大多數(shù)的動(dòng)植物器官、組織及細(xì)菌等均屬這類。對于這類樣品，在金屬鍍膜前，普通都需通過固定、脫水、干燥等解決，如不經(jīng)解決或解決不當(dāng)，就會(huì)造成樣品損傷和變形，出現(xiàn)多個(gè)假像，因此對每一解決環(huán)節(jié)都應(yīng)予以重視。但是，不管是那一類樣品的制備，都應(yīng)達(dá)成下列規(guī)定：盡量保持樣品活體時(shí)的形貌和構(gòu)造，方便如實(shí)地反映樣品原來面目。在樣品的干燥過程盡量減少樣品變形。樣品表面應(yīng)有良好導(dǎo)電性能和二次電子發(fā)射率，以避免和減少樣品的荷電效應(yīng)。樣品的前期解決掃描電鏡樣品的前期解決重要涉及表面清潔、固定、漂洗和脫水等過程。而每一過程的解決辦法基本上都是沿用透射電鏡樣品的解決辦法的，因此，這里不一多次作詳述。但是，由于兩種電鏡觀察的規(guī)定不同，因此，在解決中也有不同之處：透射電鏡重要研究樣品的內(nèi)部構(gòu)造規(guī)定內(nèi)部構(gòu)造保存好，因而樣品宜盡量小使固定液能迅時(shí)滲入固定。掃描電鏡觀察表面形貌，并且為了操作方便選用較大樣品。普通在8～10mm2左右，高度可達(dá)5mm。掃描電鏡規(guī)定完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等雜物，妨礙著觀察，以致造成對圖像的錯(cuò)誤解釋，因此，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作。下列介紹前期解決辦法：清潔'：對樣品的清潔可根據(jù)不同的樣品采用不同的辦法，其中慣用的辦法有:表面正常干燥的樣品如葉、花瓣、莖等蠟葉標(biāo)本，可用吹氣球或用除塵器吹凈，也可用軟毛筆輕掃等辦法除去表面的灰塵和其它雜物，但需注意不要損傷樣品，吹風(fēng)和清掃的力量取決于樣品的硬度和污染的程度。普通動(dòng)植物組織，可用蒸餾水、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗。至于采用何種清潔液清洗，要視組織本身對清洗液滲入壓變化的敏感程度而定，如用緩沖液清洗時(shí)，應(yīng)與配制固定液的緩沖液一致，否則會(huì)因性質(zhì)不同而產(chǎn)生化學(xué)反映從而影響固定效果。對有油脂分泌物和蠟質(zhì)覆蓋層的樣品如毛發(fā)、蚧蟲等，應(yīng)采用有機(jī)溶劑重復(fù)浸洗。對某些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑解決來清洗，如普通組織可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗；腸粘膜可用糜蛋白酶清洗；用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細(xì)胞。有些組織也可用試劑進(jìn)行清洗，如要分離神經(jīng)細(xì)胞可用稀釋的乙二胺四醋酸解決，用甘油和稀釋的乙醇延長浸漬時(shí)間能夠從分泌乳腺中除去乳汁等。對微小的樣品要用離心法或放在用鎳過濾網(wǎng)制的小容器中清洗。對于特殊的樣品還須用特殊的辦法進(jìn)行清洗。固定:樣品的固定、漂洗和脫水等解決所用的試劑和辦法基本上與透射電鏡的樣品相似，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，重要是規(guī)定保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品解決有不同之處。除采用戊二醛、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進(jìn)行固定外，還可采用下列幾個(gè)固定液：Sjodstrand固定液：A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500mlB液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉(Veronal)14.74g+雙蒸餾水500m1使用時(shí)吸取A液10ml，B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml蒸餾水Dalton氏固定液：此種固定液為4％重鉻酸鉀(pH7.2)與3.4％氯化鈉等量混和后，再與2％四氧化鋨等量混使即得。這種固定液無沉渣，對樣品損傷少。在能保持樣品不變形的前提下，不少樣品(特別是植物樣品)采用戊二醛單固定即可。為了加強(qiáng)固定效果，還可將幾個(gè)不同的固定液配合使用，進(jìn)行雙固定或多次固定(特別是動(dòng)物樣品)；如用用戊二醛作前固定，用鋨酸作后固定。脫水：脫水劑慣用乙醇和丙酮。丙酮能使組織塊變硬，是它的優(yōu)點(diǎn)。樣品的干燥生物樣品的制備中，干燥是最核心的環(huán)節(jié)。干燥過程除引發(fā)樣品收縮之外，水的表面張力會(huì)使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲入(因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶)。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水，從而使干燥過程對樣品表面產(chǎn)生的影響較少。然后就是如何設(shè)法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥。現(xiàn)在慣用的干燥辦法重要有空氣干燥法、臨界點(diǎn)干燥法、冰凍干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。空氣干燥法空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將通過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐步揮發(fā)干燥。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡樸易行和節(jié)省時(shí)間，它的致命缺點(diǎn)是在干燥過程中，組織會(huì)因脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，此種辦法普通只合用于外殼(表面)較為堅(jiān)硬的樣品。在采用空氣干燥時(shí)，為了減少樣品的收縮變形，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇、丙酮等外，還應(yīng)使樣品得到充足固定，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好。由于它會(huì)使組織變得較為堅(jiān)硬，使收縮變形減少。然而，空氣干燥引發(fā)的收縮并非完全不利，有時(shí)能夠通過收縮使細(xì)胞之間互相剝離，從而能清晰地觀察到一種個(gè)單獨(dú)存在的細(xì)胞及其表面構(gòu)造。另外，還可通過細(xì)胞成分在干燥時(shí)的收縮，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線粒體、細(xì)胞核等成分的存在。但這種機(jī)會(huì)極少，并且因收縮帶來的不利是重要的，因此，現(xiàn)在極少采用。臨界點(diǎn)干燥法臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥辦法。這種辦法由于沒有表面張力的影響，因此樣品不易收縮和損傷，此法所用的儀器構(gòu)造不甚復(fù)雜，操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長，普通約2h左右即可完畢，因此，是最為慣用的辦法。物質(zhì)的臨界點(diǎn)是18由CharlescagriddeLaTour發(fā)現(xiàn)的。他將不同的液體分別裝進(jìn)玻璃試管并密封起來，然后一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊加熱，這時(shí)，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月面開始變得含糊起來，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現(xiàn)。每種液體都存在某一溫度，在這一溫度時(shí)，液相的彎月面完全消失。那么，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之因此出現(xiàn)這種現(xiàn)象，是由于在密封的容器里，液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下，液體由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相似，因而互相混合成一種均一的流體，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了，表面張力也自然消失了。因此，所謂臨界點(diǎn)，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和液態(tài)兩相之間達(dá)成相似密度，成為均一流體狀態(tài)時(shí)的溫度和壓力的總稱。此時(shí)的溫度稱臨界溫度；此時(shí)的壓力稱臨界壓力。不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點(diǎn)，普通用于掃描電鏡樣品臨界點(diǎn)干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表10-1。如果在臨介點(diǎn)進(jìn)行干燥，由于表面張力消失就不會(huì)造成樣品表面的損傷。但進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，需用專用的臨界點(diǎn)干燥器。具體解決環(huán)節(jié)以下：固定脫水按透射電鏡常規(guī)制樣辦法進(jìn)行。純丙酮置換乙醇如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100％后，用純丙酮置換15～20min。中間液解決即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)解決15-80min(也能夠過夜)置換丙酶。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中。裝樣將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃注入液體二氧化碳依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。漂洗當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超出樣品籠為度)時(shí)，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充足擴(kuò)散，然后，打開儀器排氣流量計(jì)閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液。加溫置換將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃氣化將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃)，此時(shí)隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐步增加，達(dá)成二氧化碳的臨介點(diǎn)，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)成7134Pa時(shí)，經(jīng)5min后，即可排氣。排氣在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源)，打開流量計(jì)的排氣閥門，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更加好)。約經(jīng)45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立刻裝臺，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。臨界點(diǎn)干燥的成敗如何；與每一步的操作有很大關(guān)系，因此，操作時(shí)應(yīng)注意下列事項(xiàng)：在樣品放進(jìn)樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃，由于溫度過高，充入的液體二氧化碳會(huì)立刻氣化膨脹，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼續(xù)進(jìn)入樣品杯。樣品不適宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時(shí)送入樣品杯。由于過濕表明乙酸異戊脂太多會(huì)干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會(huì)因空氣干燥而造成樣品己變形，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒故意義了。一次加入的樣品不適宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入局限性而達(dá)不到臨界點(diǎn)。充入液體二氧化碳的量要足。由于充液量局限性，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用，普通充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右。在加溫氣化時(shí)，實(shí)際操作溫度應(yīng)超出臨界值，以確保達(dá)成充足的臨界狀態(tài)。"開"、"閉"閥門時(shí)，動(dòng)作要輕緩，盡量避免二氧化碳液對樣品產(chǎn)生忽然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，普通放氣時(shí)間應(yīng)在．4Omin以上，有時(shí)也能夠放氣過夜或過中午。二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質(zhì)的。與液體二氧化碳比較，固體二氧化碳有下列優(yōu)點(diǎn):有助于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞，若用液體二氧化碳干燥，由于二氧化碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒有這種危險(xiǎn)。不需要用鋼瓶，鋼瓶很重，搬運(yùn)麻煩；用固體二氧化碳時(shí)，有適宜大小的保溫瓶(如冰壺)就能夠了，因此很方便。能確保二氧化碳裝滿樣品室，即使用固體二氧化碳時(shí)，每次都能精確地放入足夠酌量，而不會(huì)像使用液體二氧化碳時(shí)由于鋼瓶中二氧化碳局限性，充不進(jìn)樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而造成損傷。夏天使用方便在使用液體二氧化碳時(shí)，若室溫超出臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進(jìn)入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響，即無論多熱的天氣也能放進(jìn)足夠量。不污染樣品使用液體時(shí)，往往由于鋼瓶內(nèi)有鐵銹粉末充進(jìn)樣品杯而污染樣品，而固體二氧化碳則無此種污染。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除使用專門裝置外，也可用任何一種液體臨界點(diǎn)干燥器，但是由于液體臨界點(diǎn)干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法的樣品解決{固定、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相似，所不同的是在于干燥時(shí)的具體操作。其操作環(huán)節(jié)是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末)，放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋，然后加熱到15℃，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時(shí)干燥器內(nèi)的壓力上升，再加熱到40C冰凍干燥法冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過升華，除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冰凍干燥的基礎(chǔ)是冰(或固態(tài)溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不通過中間的液態(tài),不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，因此，能較好地避免或減少了在干燥過程中對樣品的損傷。冰凍干燥辦法有兩種，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機(jī)溶劑中冰凍干燥。含水樣品直接冰凍干燥法:此法相對于臨界點(diǎn)干燥有其明顯優(yōu)點(diǎn)，即能直接使含水樣品冰凍干燥，不需要用有機(jī)溶劑脫水和置換，避免了無極性溶劑對樣品成分的抽提作用，因此，不會(huì)使樣品收縮和膜構(gòu)造或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài)，從而得到好的實(shí)驗(yàn)樣品。含水樣品冰凍干燥的環(huán)節(jié)以下：取材固定，按常規(guī)辦法進(jìn)行。冰凍保護(hù)劑滲入將樣品置于10％～20％的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15％～40％的甘油水溶液，或氯仿中浸泡數(shù)小時(shí)。驟冷將經(jīng)保護(hù)劑解決過的樣品快速投入到用液氮預(yù)冷到一150℃升華干燥將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺上(保持一70C下列),抽真空(真空度為10～10-1Pa)，經(jīng)幾小時(shí)或數(shù)天后，樣品即達(dá)成干燥；裝臺鍍膜先將冰凍干燥器的樣品臺加熱至室溫，然后將干燥器放氣，取出樣品快速裝臺粘樣，送入鍍膜儀中鍍膜。但是這種辦法也有其局限性之處，就是干燥時(shí)間太長，如單層細(xì)胞也要幾小時(shí)才干達(dá)成干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天，同時(shí)要判斷與否干燥也較為困難，冰凍過程中會(huì)形成冰晶，使細(xì)胞成分因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形，造成人為的網(wǎng)狀構(gòu)造。因此必須采用某些避免這一不良狀況產(chǎn)生的方法，以使樣品的損傷減少到能夠無視的程度。為了避免冰晶的形成，可采用下列方法：①用驟冷劑提高冰凍速度。慣用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22；另外，液態(tài)一固態(tài)氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑；②樣品脫水后的冰凍干燥:這種辦法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達(dá)成樣品干燥的；這種辦法相對于前一種辦法有下列優(yōu)點(diǎn)；即有機(jī)溶劑在冰凍時(shí)形成非晶體固態(tài)，不像水那樣結(jié)冰時(shí)膨脹，因此不會(huì)產(chǎn)生冰晶對樣品的損傷。有機(jī)溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華，因此，干燥時(shí)間比上一辦法短得多，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺即可。但此法也有局限性之處，就是有機(jī)溶劑對樣品成分有抽提作用，易造成部分內(nèi)含物丟失。此法的操作程序與前法基本相似，只是無需用冷凍保護(hù)劑解決而已?，F(xiàn)將幾個(gè)辦法介紹以下：氟利昂TF冷凍干燥法：固定脫水按常規(guī)辦法進(jìn)行。置換按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液，并通過這些混合液將樣品逐步引入100％氟利昂TF。冷凍把樣品浸入液氮中冷凍。干燥將樣品放在預(yù)先冷卻的鋁座上，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa)，經(jīng)0～20min后即完全干燥。90min后鋁座變?yōu)槭覝?，即取出樣品、裝臺、鍍膜觀察。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種運(yùn)用乙腈在急速蒸發(fā)時(shí)會(huì)冷卻固化這一性質(zhì)，將樣品干燥的很獨(dú)特的辦法。其操作環(huán)節(jié)以下：固定、水洗按常規(guī)辦法進(jìn)行。脫水使用上升的系列乙腈(50％～100％)脫水各20min。滲入在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈，并投入樣品。升華把容器放入真空噴鍍儀中抽真空，此時(shí)由于乙腈急速蒸發(fā)而使容器急劇冷卻，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使乙腈升華，約經(jīng)30min，樣品即達(dá)干燥。待容器回升到室溫后，即可取出樣品裝臺鍍膜進(jìn)行觀察。據(jù)田中敬一報(bào)道此法干燥的效果與臨界點(diǎn)干燥沒有什么不同。茨烯干燥法莰烯是一種樟腦類無色結(jié)晶體，能溶于醚、環(huán)乙烷、環(huán)己烯和氯仿中，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華，從固態(tài)直接變成氣態(tài)，表面張力小，故經(jīng)它干燥的樣品較松軟，變形小，操作也較簡便。莰烯干燥法是由Warrens．Buk于1971年提出的，其操作環(huán)節(jié)以下：取新鮮材料快速投入0．1mol/L磷酸緩沖液中漂洗，然后投入5％的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h。轉(zhuǎn)至加有5.4％蔗糖的0．1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過夜。用l％的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h。用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次、15min。用30％，50％，70％，90％，95％和100％丙酮脫水，每級15min。用100％的苯脫酯。在1：1苯與環(huán)氧丙烷中浸泡15min，