中藥有效成分的藥效學(xué)研究

中藥有效成分的藥效學(xué)研究

服藥是中醫(yī)學(xué)的特點，主要指寒、熱、熱、冷。這是中醫(yī)復(fù)雜療效的高度概括。中藥有效成分的分離、提取、研發(fā)是中藥學(xué)發(fā)展的重要方向,而伴隨的關(guān)鍵性基礎(chǔ)問題之一是如何判斷其藥性,以及是否與其藥材的藥性一致。因此探索和建立中藥有效成分藥性的檢測方法十分必要。近幾年,常用實驗動物大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)化、計量化證候檢測方法的建立,以及證候動物模型的發(fā)展,給中藥及中藥有效成分藥性的檢測提供了方法。本研究探索并采用優(yōu)甲樂熱證造模及小鼠計量化診法和辨證方法,同步檢測比較小檗堿等7味中藥有效成分與其對應(yīng)的黃柏等6味中藥飲片藥性,探索建立中藥有效成分藥性實驗檢測與評價的方法。1材料表面1.1設(shè)定52采用清潔級雄性昆明小鼠,體質(zhì)量(25±2)g,共204只。由中科院上海實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(滬)2003-0003。1.2河北知母、充放電型①道地中藥飲片藥材:一次性購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?許可證:滬Y20060185),產(chǎn)地:河北知母、四川黃柏、廣西生梔子、甘肅生大黃、廣西苦參、山西生黃芪、遼寧生曬參、山西淫羊藿、四川制附子、四川制吳茱萸等。②中藥有效組分:菝契皂苷元、小檗堿、梔子苷、大黃酚、大黃素、淫羊藿苷、烏頭堿等,均購自上海西寶生物技術(shù)有限公司。1.3口藥品注冊號優(yōu)甲樂(MerckKGaA,進(jìn)口藥品注冊證號:H20090234);其它試劑(乙醚、丙酮、乙醇、生理鹽水)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。2方法2.1黃酚、大黃素、平均的生物量第1批實驗:設(shè)正常、模型對照、黃柏、小檗堿、大黃、大黃酚、大黃素、附子組。共計8組,每組96只。第2批實驗:設(shè)正常、模型對照、梔子、梔子苷、知母、知母苷、淫羊藿、淫羊藿苷、烏頭堿組。共計9組,每組108只。2.2藥汁濃縮組采用1g生藥/1l的方法取知母、黃柏、生梔子、生大黃、苦參、生黃芪、生曬參、淫羊藿、制附子、制吳茱萸等10味中藥飲片各100g。用自來水1∶10浸沒2h,武火煮沸后,文火保持微沸30min,取藥汁,趁熱抽濾;藥渣中加入6倍自來水,武火煮沸后,文火保持微沸20min,取藥汁,趁熱抽濾;合并2次濾液,80℃恒溫水浴鍋濃縮至1g生藥/1ml的濃度。倒入無水乙醇,與藥汁比例為2∶1,4℃冰箱過夜,48h后懸蒸醇提,每味中藥飲片得到1g生藥/ml的藥汁各100ml。4℃儲存?zhèn)溆?。根?jù)《中國藥典》2005年版記載,(見表1)各有效組分用相應(yīng)的助溶劑助溶,再根據(jù)生藥中單體的含量比例,用純凈水調(diào)整藥物濃度配制成相當(dāng)于1g中藥生藥/ml的濃度。2.3優(yōu)甲樂內(nèi)經(jīng)綜合征型小鼠模型優(yōu)甲樂小鼠實熱證候模型:優(yōu)甲樂片混懸液3.75μg/10g,一次灌胃給藥。2.4小鼠的用藥量小鼠用藥劑量依據(jù)主要成分的得率換算至成人每千克體質(zhì)量的20倍。調(diào)整藥物濃度如下:黃柏、梔子、苦參、生曬參、制附子、生大黃、淫羊藿、知母等稀釋至0.1666g/ml,灌胃0.5ml,每只小鼠每天的用藥量為0.0833g;生黃芪稀釋至0.3332g/ml,灌胃0.5ml,每只小鼠每天的用藥量為0.1666g;制吳茱萸稀釋至0.0833g/ml,灌胃0.5ml,每只小鼠每天的用藥量為0.0416g。正常組和模型對照組則灌以等量的生理鹽水。2.5小鼠體內(nèi)紅外熱像檢測①數(shù)字WMY-01型溫度計,檢測腋溫。②ThermaCAMP30紅外熱像儀,檢測小鼠體表紅外熱像;采用配套軟件提取眼溫和尾根部溫:取頭側(cè)眼部區(qū)域最高溫度、取背延長線與尾根部中線交匯點溫度,具體定位見圖1。③綜合溫度:綜合溫度=腋溫×70%+眼紅外×20%+尾紅外×10%。2.6小鼠時間點的檢測根據(jù)造模以及中藥藥代動力學(xué)文獻(xiàn),每只小鼠時間點如下:首次紅外、腋溫檢測后,0h造模給藥,1h中藥及有效組分給藥;3h給藥后紅外、腋溫檢測。2.7大學(xué)生的反應(yīng)各批次所有小鼠檢測值與對應(yīng)的正常組均數(shù)比值,得到試驗前t1和試驗后t2兩組檢測比值;t2/t1值系受試小鼠對給藥藥性的反應(yīng)。應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件,采用單向方差分析,求出對應(yīng)各組t2/t1的均數(shù)和誤差,進(jìn)行多個樣本均數(shù)比較和樣本均數(shù)間的比較以此說明各個用藥組的差異。當(dāng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher方差分析時,如果發(fā)現(xiàn)Levene檢驗方差不齊,則選擇了方差不齊的近似F檢驗Welch法和Brown-Forsythe法對F值和自由度進(jìn)行校正,而后進(jìn)行方差分析。3結(jié)果3.1大黃素-明目酚、天麻酚、麻黃①優(yōu)甲樂造模后3h,與正常對照組相比,小鼠腋溫接近正常對照組(見圖2～3)。與優(yōu)甲樂造模組相比。②黃柏、小檗堿給藥后腋溫下降(P<0.05),性寒。③大黃、大黃素給藥后腋溫下降(P<0.05),大黃酚呈下降趨勢,三者藥性一致,性寒,程度存在差異。④附子(圖2)給藥后腋溫有下降趨勢,未見熱性表現(xiàn);而烏頭堿(見圖3)腋溫反而大降(P<0.05),系毒性反應(yīng)。⑤梔子、梔子苷給藥后腋溫下降(P<0.05),兩者藥性一致,性寒(見圖3)。⑥知母、知母皂苷給藥后腋溫下降(P<0.05),兩者一致,性寒。⑦淫羊藿和淫羊藿苷給藥后對腋溫的影響不大。3.2不同組分的對藥單優(yōu)甲樂造模后3h,與正常對照組相比,小鼠眼紅外溫下降(P<0.05)或有下降趨勢(見圖4～5)。與優(yōu)甲樂造模組相比:黃柏和小檗堿、大黃和大黃素及大黃酚、梔子和梔子苷、知母和知母皂苷,以及附子等給藥后沒有顯著的改變。烏頭堿(見圖5)眼紅外測溫值有下降趨勢,系毒性反應(yīng)。淫羊藿和淫羊藿苷(見圖5)眼紅外測溫值升高(P<0.05),或具有升高趨勢,提示藥性偏熱。3.3不同試劑對樂造組分毒性的影響優(yōu)甲樂造模后3h,與正常對照組相比,小鼠尾紅外測溫改變不明顯(見圖6～7)。與優(yōu)甲樂造模組相比:黃柏和小檗堿、大黃和大黃酚尾溫有下降趨勢,大黃素下降(P<0.05),性寒。梔子和梔子苷、知母和知母皂苷沒有顯著的改變。烏頭堿尾溫下降(P<0.05),系毒性反應(yīng)(見圖7)。淫羊藿和淫羊藿苷尾溫升高(P<0.05),藥性偏熱(見圖7)。3.4小堿、天麻酚、大黃素p>0.05和梔子苷、知母皂苷p1優(yōu)甲樂造模后3h,小鼠綜合體溫接近正常對照組(見圖8～9)。與優(yōu)甲樂造模組比較:黃柏、大黃與大黃素(P<0.05)下降,小檗堿、大黃酚有下降趨勢,性寒(見圖8)。梔子苷和梔子、知母和知母皂苷均有下降趨勢,性偏寒(見圖9)。烏頭堿下降(P<0.05)系毒性反應(yīng)。淫羊藿苷升高(P<0.05),淫羊藿有升高趨勢,藥性熱(見圖9)。4討論4.1中藥用藥的確定中藥有效成分提取是中藥制劑發(fā)展的方向,伴隨的主要問題之一是所提取的中藥有效成分是否具有藥性,藥性是否與原藥材一致,一味中藥所含有的多種有效成分,其藥性是否一致,能不能代表原藥材?如果藥性不明確,是否還能視為中藥?這些問題懸而未決,將影響中藥現(xiàn)代化、中藥創(chuàng)新藥物的研發(fā)。因此,借鑒歷史上中藥藥性判斷的方法,建立標(biāo)準(zhǔn)化中藥有效成分、中藥飲片等藥性實驗檢測方法十分必要。4.2代動力學(xué)檢測基于臨床上甲亢患者具有熱證或低熱表現(xiàn)實驗采用甲狀腺素制作熱證模型已多有報道。利用優(yōu)甲樂造模小鼠代謝加快的特點,將有助于判斷寒熱中藥藥性的作用。我們的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),優(yōu)甲樂混懸液灌胃后,小鼠體溫輕度下降,至灌胃3h會出現(xiàn)一過性體溫回升,接近或略超過正常水平,與優(yōu)甲樂藥代動力學(xué)檢測其血T4峰值水平出現(xiàn)于服藥后2～4h一致。因此,選擇優(yōu)甲樂混懸液灌胃后3h作為檢測時間點。4.3灌胃給藥后最大吸收峰有關(guān)藥代動力學(xué)文獻(xiàn)表明,本實驗所選用中藥及其主要成分,灌胃給藥后最大吸收峰多在1h左右,2h可廣泛分布于各組織中。因此,選擇中藥有效成分和中藥灌胃給藥后2h作為檢測時間點。4.4綜合溫度:主要分為3.腋溫檢測體表溫度。體表溫度是受試者寒熱感受的主要依據(jù),而且腋溫檢測方法相對穩(wěn)定;從本實驗的結(jié)果看,腋溫的改變也最符合被檢中藥的藥性。眼紅外所采集的眼溫,反映體內(nèi)溫度,相對恒定,變化幅度小。尾紅外采集的尾根部溫度,系體表溫度,但易受測距的小幅改變、環(huán)境溫度等因素的影響,穩(wěn)定性較差。因此,綜合溫度采用腋溫×70%權(quán)重、眼紅外×20%權(quán)重,以及尾紅外×10%的權(quán)重;四診合參,可以作為判斷藥性的一個綜合性指標(biāo)。4.5中藥飲片的熱性能本實驗表明,選用中藥飲片黃柏、大黃、梔子、知母、淫羊藿等所檢測出的藥性與大多中藥文獻(xiàn)描述一致,證明本方法是可行的;一些中藥有效成分與中藥飲片的藥性一致,如小檗堿與黃柏、大黃素和大黃酚與大黃、